Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Краткая история вопроса 10
1.2 Структурное разнообразие АМП 12
1.3 Молекулярная биология антибиотических пептидов 27
1.4 Механизмы антимикробного действия антибиотических пептидов 36
1.5. К вопросу о разнообразии антимикробных пептидов 50
1.6 Функциональные свойства АМП, отличные от антимикробной активности 52
1.7 Прикладные исследования 55
1.8 О состоянии современных знаний об АМП у разных групп животных 56
1.9 Заключение 59
2. Методы исследования 61
2.1 Получение биологического материала 61
2.2 Цитохимические методы 62
2.3 Экстрагирование катионных пептидов 63
2.4 Методы электрофореза 63
2.5 Методы окраски пептидов в полиакриламидных гелях 65
2.6 Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография 66
2.7 Методы определения концентраций пептидов 66
2.8 Методы определения дисульфидных связей в молекулах пептидов 67
2.9 Методы определения молекулярной массы пептидов 68
2.10 Процедура переноса пептидов HaPVDF мембрану 69
2.12 Определение аминокислотной последовательности пептидов 69
2.13 Методы определения антимикробной активности пептидов 70
2.14 Определение воздействия пептида на проницаемость внутренней мембраны Exoli 74
2.15 Метод определения гемолитической активности пептидов 76
2.16 Метод оценки хемотаксической активности целомоцитов пескожила 77
2.17 Статистическая обработка результатов 77
2.18 Использованные для сравнительных исследований препараты антимикробных пептидов были получены из следующих источников: 78
2.19 Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей 78
3. Результаты исследования 79
3.1 Анализ препаратов 79
3.2 Выделение и очистка антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила 85
3.2.1 Выделение и очистка ареницинов 85
3.2.2 Определение аминокислотной последовательности ареницинов 91
3.2.3 Выделение и очистка других катионных антимикробных пептидов 91
3.4 Изучение функциональных свойств ареницина-1 102
3.4.1 Исследование антимикробной активности in vitro 102
3.4.1.1 Изучение влияния различных условий среды на проявляемую ареницином
антимикробную активность 104
4.3.2 Изучение влияния ареницина-1 на изменение проницаемости цитоплазматической мембраны грам-отрицательной бактерии Escherichia coli ML-35p ПО
4.3.3 Изучение гемолитической активности ареницинов 115
4.3.4 Взаимодействие ареницина-1 с лизоцимом человека 118
4.3.5 Изучение способности арницина-1 вызывать направленную миграцию целомоцитов пескожила 119
4. Обсуждение результатов 121
4.1 Анализ препаратов целомоцитов 121
4.2 Выделение, очистка и определение первичной структуры ареницинов 122
4.3 Выделение, очистка и характеристика других антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила 128
4. 4 Функциональные свойства ареницина-1 130
4.4.1 Антимикробная активность in vitro 130
4. 4. 2 Влияние ареницина-1 на изменение проницаемости цитоплазматической
мембраны грам-отрицательной бактерии Escherichia coli ML-35p 136
4.4.3 Гемолитическая активность ареницина-1 140
4.4.4 Взаимодействие ареницина-1 с лизоцимом 142
4.4.5 Хемотаксическая активность ареницина-1 в отношении целомоцитов пескожила 145
5. Выводы 148
6. Список литературы 150
- Молекулярная биология антибиотических пептидов
- Методы определения антимикробной активности пептидов
- Выделение и очистка ареницинов
- Выделение, очистка и определение первичной структуры ареницинов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Микроорганизмы представляют собой постоянную угрозу для всех многоклеточных животных, которые сохраняют способность к самоподдержанию и самовоспроизведению лишь постольку, поскольку могут противостоять агрессивному потенциалу окружающей их микробной флоры. Необходимым условием эволюции всего живого являлось развитие защитных механизмов, т.е. способности противостоять инфекциям - иммунитета.
Иммунитет представляет собой совокупность факторов, способных распознавать, изолировать, уничтожать или ограничивать экспансию чужеродных элементов. Уже в середине 20-го века иммунологи четко различали иммунитет естественный и приобретенный. Первый из них понимали как «невосприимчивость, обусловленную врожденными биологическими особенностями, присущими данному виду, как наследуемый видовой признак» (цит. По А. Зильберу). Приобретенный иммунитет рассматривали как резистентность к инфекции, возникшую в течение индивидуальной жизни вследствие контакта с потенциальным патогеном. В дальнейшем для обозначения естественного иммунитета были предложены термины «врожденный» и «неспецифический». Приобретенный иммунитет определили как «специфический» или «адаптивный».
У беспозвоночных и древнейших позвоночных животных (круглоротых) защиту от инфекций и паразитарных инвазий обеспечивает совокупность факторов врожденного иммунитета.
У позвоночных животных в дополнение к врожденной появилась система иммунитета адаптивного, основными чертами которого являются индуцибельность, высокая специфичность, формирование иммунологической «памяти». Врожденный иммунитет обеспечивает защиту на первых этапах взаимодействия организма с патогенами и играет важную роль в модуляции и регулировании дальнейших адаптивных процессов. Именно с помощью механизмов врожденного иммунитета осуществляется контроль над уровнем естественной микрофлоры организма.
В последнее время все большее значение приобретает изучение механизмов врожденного иммунитета. Особый интерес представляет группа беспозвоночных животных. Успешное выживание в среде, изобилующей микроорганизмами свидетельствует об эффективности функционирования их защитных систем. При этом многие процессы, из которых слагается сложнейший иммунный ответ у позвоночных, у беспозвоночных нередко представлены в более простой и доступной для анализа форме.
Врожденный иммунитет складывается из клеточного и гуморального звеньев. Наиболее распространенными и универсальными являются механизмы фагоцитоза и агрегации клеток полости тела, гемоцитов или целомоцитов у беспозвоночных, и нейтрофилов и макрофагов у млекопитающих. Гуморальные факторы представлены белками плазмы крови или цел омической жидкости (Кокряков В.Н., 1999; Хаитов, 2000; Климович В.Б., 2002).
В течение последних 20 лет стало ясно, что традиционное представление об эффекторных молекулах врожденного иммунитета является неполным без учета роли катионных антимикробных пептидов (АМП). Открытие этих веществ вызвало очень большой интерес исследователей во всем мире, и накопленные к настоящему моменту сведения позволяют сделать вывод о том, что антибиотические пептиды являются ведущими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета. Эти вещества являются древнейшими факторами защиты всех видов живых организмов и обнаруживаются в органах и тканях, для которых наиболее вероятен контакт с внешним патогеном, (поверхностные и слизистые эпителии, гранулы фагоцитарных клеток, гемолимфа и целомическая жидкость), что косвенно свидетельствует в пользу их участия в обеспечении неспецифической антимикробной резистентности (Кокряков, 1999).
К АМП относят группу пептидов, обладающих следующими свойствами: они положительно заряжены (минимальный положительный заряд +2, чаще +4,+5, в зависимости от содержания аминокислотных остатков лизина, аргинина и гистидина), имеют низкую молекулярную массу (не более ЮкДа) и формируют такую третичную структуру, в которой гидрофобные и гидрофильные боковые радикалы аминокислот пространственно разобщены, т.е. молекула является амфипатической (важную роль в стабилизации подобной структуры играют внутримолекулярные дисульфидные связи). Эти свойства лежат в основе механизма действия АМП на клетки патогенов. Действие подавляющего большинства АМП направлено на дестабилизацию и в конечном итоге разрушение клеточной мембраны, что вызывает серьезные системные повреждения, несовместимые с жизнедеятельностью микробной клетки.
Помимо трех указанных выше общих качеств АМП демонстрируют большое разнообразие первичных и надпервичных структур и имеют разный характер функциональной активности.
Многие АМП проявляют высокую активность против грам-отрицательных и грам-положительных бактерий, грибов, некоторых оболочечных вирусов (дефенсины), некоторые цитотоксичны в отношении эукариотических клеток. Другие пептиды имеют более ограниченный спектр действия (цекропины, профенины). Даже небольшие изменения в структуре молекулы могут оказывать значительное влияние на ее активность. Понимание соответствия между структурой и активностью является одним из важнейших направлений исследований. В дополнение к основной функции умерщвления микроорганизмов, некоторые изученные антимикробные пептиды (в частности дефенсины человека) обладают целым спектром функциональных свойств, свидетельствующих об их участии во взаимодействии систем врожденного и приобретенного иммунитета (хемотаксическим, способностью к модуляции продукции цитокинов, антисептическим, кортикостатическим и др.) (Кокряков, 1999; Gennaro, Zanetti, 2000; Yang etal., 2004).
Показана возможная роль и в других физиологических процессах (атерогенезе, заживлении ран и свертывании крови (а-дефенсины) (Raj, Dentino, 2002)), есть данные о воздействии дефенсинов человека и насекомых на ионные каналы (MacLeod et al., 1991; Bateman et al, 1996).
Все это указывает на многофункциональность антимикробных пептидов, реализация которой может в значительной степени определять эффективность защитных реакций организма (Кокряков, 1999).
Необходимо учитывать, что in vivo АМП действуют кооперативно друг с другом и другими факторами системы врожденного иммунитета, обеспечивая наиболее эффективную защитную реакцию организма-хозяина.
Хотя исследования АМП животных проводятся уже более 40 лет, видовой состав организмов, которые были изучены в этой области, составляет ничтожную часть от общего числа известных видов.
Для понимания закономерностей эволюции механизмов противоинфекционной защиты, необходимо дальнейшее накопление знаний о структуре и функциональных свойствах АМП у разных видов живых организмов. С точки зрения сравнительной биохимии представляет интерес изучение АМП у представителей ключевых в эволюционном плане групп животных.
Поиск новых АМП важен не только с фундаментальной, но и с практической точки зрения. Как антимикробные агенты АМП весьма перспективны для разработки на их основе новых лекарственных препаратов, «антибиотиков животного происхождения». Они лишены многих недостатков свойственных традиционно применяемым антибиотикам (против их действия редко вырабатывается резистентность, не развивается эндотоксемия), и представляют собой сформировавшиеся в процессе эволюции молекулярные матрицы, естественные для организмов (Кокряков, 1999; Gennaro, Zanetti, 2000; Gallo et al., 2002; Bevins, 2003; Yang et al., 2004).
Выбор в качестве объекта исследований представителя класса многощетинковых червей кл. Polychaeta (т. Annelida) определялся тем, что, в соответствии с современными представлениями, полихеты являются ключевой группой в эволюции трохофорных животных, давшей начало моллюскам и членистоногим. Антимикробные пептиды у этих животных еще не были обнаружены другими исследователями, хотя были описаны другие (высокомолекулярные) белковые антимикробные факторы (Cooper et al., 2002).
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выявление и изучение структурных и функциональных свойств антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила Arenicola marina L.. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Поиск, идентификация и очистка антимикробных пептидов;
2. Изучение физико-химических свойств, определение первичной структуры выделенных пептидов;
3. Изучение функциональных свойств выявленных пептидов.
Научная новизна. В работе впервые было проведено комплексное изучение антимикробных пептидов целомоцитов пескожила и показано, что они обладают целым спектром антимикробных пептидов.
Был выявлен и очищен до гомогенного состояния ряд антимикробных пептидов.
Среди выделенных пептидов было охарактеризовано две изоформы новых антимикробных пептидов названных нами ареницинами, которые можно отнести к новому структурному семейству.
Получены данные, характеризующие антимикробную и гемолитическую активность ареницина-1.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Целомоциты пескожила содержат целый ряд катионных антимикробных пептидов Из целомоцитов выделено в чистом виде 11 антимикробных пептидов. Среди всех охарактеризованных антимикробных пептидов особый интерес представляют новые антимикробные пептиды ареницины. Ареницины являются пептидами с уникальной структурой, принадлежащей к новому структурному семейству.
2. Ареницин-1 является эффективным антибиотическим агентом с широким спектром действия на микроорганизмы, причем его антимикробная активность остается стабильной в широком диапазоне условий. Как и у подавляющего большинства антимикробных пептидов бактерицидное действие ареницина-1 является следствием взаимодействий молекулы пептида с цитоплазматической мембраной клетки. По эффективности микробоцидного действия ареницин-1 сравним с самыми сильными пептидными антибиотиками. Несмотря на присущую ареницину способность вызывать гемолиз эритроцитов, гемолитическая активность начинает проявляться при высоких концентрациях пептида, намного превышающих минимальные ингибирующие концентрации, установленные в отношении микроорганизмов.
Молекулярная биология антибиотических пептидов
К настоящему времени изучена структура генов большинства антибиотических пептидов. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих, как а, так и (5 дефенсины. Гены гематопозтических а- и 0-дефенсинов состоят из трех экзонов, в то время, как гены эпителиальных а-дефенсинов и большинства Р-дефенсинов имеют только по два экзона. Кателицидиновые гены включают в свою структуру четыре экзона. (Jones, Bevins, 1992; Jones, Bevins, 1993; Bevins, 2003). У человека гены дефенсинов локализованы на 8 хромосоме band р23. Известны нуклеотидные последовательности генов более 20-ти антибиотических пептидов насекомых (Xanthopoulos et al., 1988; Kania, Natori, 1989; Samakovlis et al., 1991). Каждый из этих генов имеет в своей структуре один интрон, варьирующий в размерах от 58 до 2451 пар оснований. Было обнаружено, что интрон цекропина Hyalophora содержит транспозон Mariner. Позднее оказалось, что Mariner содержится внутри многих генов антимикробных пептидов, и этот факт является свидетельством возможности эволюции генов АМП путем их горизонтального переноса (Вошап, 2000). Исключением являются гены дефенсинов дрозофилы и ген дрозомицина, которые вовсе лишены интронов. Все АМП синтезируются в виде молекул-предшественников. Препропептиды дефенсинов млекопитающих обычно состоят из сигнальной последовательности (19 аминокислот), пропоследовательности (40-45 аминокислотных остатков) и последовательности, соответствующей зрелому пептиду. При этом у дефенсинов млекопитающих проучасток и последовательность зрелого дефенсина кодируются разными экзонами (Bevins, 2003). Молекулы-предшественники дефенсинов насекомых состоят из сигнальной последовательности, пропоследовательности, состоящей из 30 аминокислотных остатков, и последовательности, соответствующей зрелому дефенсину, локализованной на С-конце. В отличие от высококонсервативной сигнальной последовательности, проучасток молекулы предшественника слабо консервативен. В генах дефенсинов моллюсков и нематод пропоследовательность находится после участка, кодирующего зрелый пептид (Zhang, Kato, 2003). Существуют и пептиды, в генах которых вовсе отсутствует пропоследовательность (например, токсины скорпионов и дефенсины растений). Проучасток дефенсинов беспозвоночных и позвоночных отличается высоким содержанием дикарбоновых аминокислот (глутаминовой и аспарагиновой), что, по-видимому, уравновешивает положительный заряд последовательности зрелого пептида, и таким образом, предотвращает нежелательные взаимодействия в процессе синтеза дефенсинов и их внутриклеточной компартментализации (Linzmeier et al., 1993). Анализ 28 последовательностей дефенсинов 5 видов млекопитающих, проведенный Хьюджесом и Игером (Hughes, Yeager, 1997), показал, что дупликация генов дефенсинов у млекопитающих в процессе эволюции сопровождалась неслучайными изменениями структуры их пропоследовательности, уравновешивающими положительный заряд последовательности, соответствующей зрелому дефенсину. Особенного упоминания заслуживает семейство кателицидинов. Эти АМП синтезируются в виде молекулы предшественницы, N-концевой участок которой представлен высококонсервативным, необычно большим полипептидом из 100 аминокислотных остатков гомологичным по структуре ингибитору катепсина L из нейтрофилов свиньи (кателину). В процессе эволюции пептидов данного семейства изменения преимущественно происходили только в части, кодирующей С- концевой зрелый пептид, который вследствие этого может принадлежать к разным структурным классам (линейные а-спиральные молекулы (ВМАР-34), пептиды с высоким содержанием пролина и аргинина (PR-39), протегрины). Кателицидины в настоящее время обнаружены только у млекопитающих. Кателиновым доменом обладают протегрины, бактенецины, индолицидин и др. Все известные кателицидины локализованы в гранулярном аппарате нейтрофилов и некоторых эпителиальных клеток. Кателицидиновые гены состоят из 4-х экзонов и интронов, кодирующая часть для препро-участка содержится в 1-3 экзонах, а собственно антимикробный пептид кодируется 4-м экзоном. Такая структурная организация консервативна у разных видов. У всех секвенированных генов в 5-фланкирующей области ДНК находится несколько консенсусных последовательностей для связывания ядерных факторов, участвующих в гемопоэзе и воспалении (Gennaro, Zanetti, 2000). Функция кателинового домена до сих пор остается неизвестной, сравнительный структурный анализ показал его сходство с семейством цистатинов. Так как эти белки способны ингибировать цистеиновые и сериновые протеиназы, можно предположить такую же функцию и для кателина, однако в нем отсутствует несколько важных последовательностей, участвующих во взаимодействии цистатинов с протеиназами. Следовательно, такое взаимодействие у кателина протекает по другому механизму или не имеет места вообще. Скорее всего, кателин служит внутренним шапероном, способствующим упаковке активного пептида в гранулы, а также защищает от действия неспецифических протеаз и направляет сайт-специфическое разрезание пропептида перед секрецией из нейтрофилов зрелых пептидов (Zanetti et al., 1995). Природа ферментов, участвующих в процессинге зрелых пептидов установлена не во всех случаях. Так, пока нет данных относительно ферментативного аппарата участвующего в посттрансляционном процессинге и сплайсинге 6-дефенсинов. В процессинге «криптидинов» (а-дефенсинов из клеток Панета мышей) участвует фермент матрилизин ММР-7 (матриксная металло-эндопротеиназа) (Wilson et al., 1999). Другой фермент этого же семейства ММР-2 участвует в регуляции образования антимикробного пептида паразина 1, который является фрагментом гистона Н2А (Cho et al., 2002). За процессинг а-дефенсинов из клеток Панета человека отвечают три формы трипсина, синтезируемые в тех же клетках (Lehrer, Ganz, 2002). В нейтрофилах человека кателицидины процессируются дипептидил аминопептидазой (возможно эластазой или катепсином G ) (Zaiou,Gallo, 2002), при экзоцитозе предшественников пептидов во внеклеточную среду их процессинг осуществляется с помощью гранулярной сериновой протеиназы 3. Некоторые кателицидины (например кроличий pl5s) не имеют сайтов разрезания для эластазы и обнаруживаются только в непроцессированной форме. Человеческий LL-37 пропептид тоже был обнаружен циркулирующим в плазме крови в ассоциации с липопротеинами.
Методы определения антимикробной активности пептидов
Метод использовали для выявления пептидов, обладающих антимикробной активностью в ПААГ после ЭФ в кислой среде (Lehrer R. et al, 1991). В данной методике нами использовались только три вида микроорганизмов грамотрицательные бактерии Escherichia coli, грам-положительные бактерии Listeria monocytogenes, гриб Candida albicans.
После ЭФ гели отмывали 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4, 2 раза по 15 мин. Далее отмытый гель накладывали на чашку с агарозным гелем (1% агароза, 0,01 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,4), содержащим 4x105 КОЕ/мл микроорганизмов, и помещали в термостат (37С) для инкубации в течение 3 часов. После инкубации чашки заливали 1% агарозой с 6% питательной средой (триптический гидролизат сои, в случае бактерий, для Candida albicans использовали селективную среду Сабуро) и оставляли на 16 часов при температуре 37С. Фиксацию роста микроорганизмов производили с помощью 5% УК.
Для данного метода использовали по четыре параллельные пробы каждого образца, нанося их на отдельные ПААГ. Три из них использовали для выявления антимикробной активности. Последний окрашивали Кумасси Бриллиантовым Голубом G-250, для выявления полос, соответствующих зонам лизиса.
Для определения антимикробной активности индивидуальных фракций использовали метод радиальной диффузии пептидов в агарозном геле, содержащем микроорганизмы, (Lehrer RI et al, 1991). В чашки Петри заливали агарозный гель (1% агароза, 0,01 М натрий-фосфатный буфер рН 7,4), содержащий 4x105 КФЕ/мл микроорганизмов в логарифмической стадии роста (для бактерий) (т.н. «нижний» гель), в застывшем геле делали лунки размером 3.0x1.5 мм. Пробы (растворенные в 5 мкл 0.01% уксусной кислоты) наносили в лунки в агарозном геле и инкубировали чашки в течение 3 часов при температуре 37С, для диффузии компонентов пробы в агарозу . В случае изучения влияния на активность пептидов различных условий среды в состав буфера для нижнего геля вносились соответствующие изменения (вносили 100-300 тМ NaCl, изменяли рН буфера от 5,8 до 8, добавлялиі мМ цитрат Na или 0,1% питательную среду).
После инкубации чашки заливали 1% агарозой с 6% питательной средой (триптический гидролизат сои) и оставляли на 16 часов при температуре 37С. Фиксацию роста микроорганизмов производили с помощью 5% УК. Антимикробная активность рассчитывалась по формуле: (d зоны ингибирования роста микроорганизмов (мм) - СІЛунки (мм) )Х 10(уСЛОВНЬІЄ еДИНИЦЫ аКТИВНОСТИ) Зона ингибирования роста микроорганизмов - область геля, рост бактерий в которой подавлен анализируемым образцом, который диффундировал в агарозный гель из лунки. Для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) тестировались последовательные разведения пептида в два раза от 100 мкг/мл до 1 мкг/мл. Точка пересечения графика линейной регрессии значений антимикробной активности с осью абсцисс принималась в качестве МИК. Каждое разведение тестировалось в трипликатах, эксперименты повторяли три раза. Каждой точке на графиках соответствует среднее значение из трех независимых экспериментов. Бактерицидное действие ареницина оценивалось методом подсчета колоний. Несколько аликвот (195 мкл) подготовленной, как описано выше, бактериальной суспензии помещали в лунки стерильного 96-луночного планшета, в которых уже находилось 5 мкл раствора ареницина в 0.01% уксусной кислоте (конечная концентрация 1.5 мкг/мл) или 5 мкл 0.01% уксусной кислоты. Пробы тщательно перемешивали и ставили в термостат 37С (на трясучку). Через определенные промежутки времени 0, 5, 10,15,20, 30, 45, 60, 90, 120 минут отбирали аликвоты (20 мкл) из лунок, содержащих пептид и из лунок с интактной бактерией. Отобранные аликвоты сразу же перемешивались с жидкой (42С) 1% агарозой (7 мл) содержащей 3% питательную среду и заливались в чашки Петри. Чашки инкубировались при 37С в течении 16-18 часов, после чего фиксировались 5% уксусной кислотой. Подсчет колоний проводился визуально. Для оценки влияния на антимикробную активность ареницина сыворотки, а так же оценки кооперативных взаимодействий ареницина и лизоцима мы посчитали наиболее адекватным использовать метод определения антмикробной активности пептида в жидкой среде (налаженный в нашей лаборатории Берловым М.Н. (Берлов М.Н., 2004)). В качестве объектов для определения антимикробного действия белков использовали культуры следующих микроорганизмов: Escherichia coli, штамм ML-35p (грамотрицательная бактерия), Listeria monocytogenes, штамм EGD (грамположительная бактерия). Рост бактерий в присутствии антимикробных белков оценивали фотометрическим методом в присутствии ресазурина. Ресазурин является веществом, которое может быть использовано в качестве маркера окислительно-восстановительного состояния среды (Maeda et al., 2001; Shiloh et al., 1997). В окисленном состоянии (ресазурин) вещество имеет максимум поглощения при 602 нм и не флуоресцирует. В восстановленном состоянии (ресоруфин) максимум поглощения сдвигается к длине волны 571 нм, проявляются флуоресцентные свойства вещества (Maeda et al., 2001). Таким образом, за превращением ресазурина в ресоруфин можно следить двумя способами: по изменению флуоресценции или оптической плотности. Наличие в среде активно метаболизирующих и делящихся клеток, в том числе бактериальных, как раз приводит к такому превращению, которое происходит под действием бактериальных дегидрогеназ (Shiloh et al., 1997; Gabrielson et al., 2002). Это позволяет использовать ресазурин для оценки роста бактерий. Фактически, данным методом оценивается не собственно рост микроорганизмов, а их метаболическая активность. Тем не менее, было показано, что результаты, получаемые этим методом, хорошо коррелируют с результатами, получаемыми общепринятым в микробиологических исследованиях методом подсчета колоний (Shiloh et al., 1997). Использование ресазурина позволяет существенно увеличить чувствительность метода, что важно с точки зрения экономии препаратов. Особенно заметна разница для L. monocytogenes. Микроорганизмы предварительно культивировали в течение ночи при температуре +37С в 3% триптическом гидролизате сои (ТГС). Суспензию ночной культуры бактерии центрифугировали при 500 g 10 минут, затем отмывали дважды холодным (+4С) 0,01 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4, путем центрифугирования при тех же условиях. Осадок ресуспендировали в том же буфере и определяли концентрацию бактерий измерением оптической плотности суспензии при длине волны 620 нм, исходя из того, что одна единица оптической плотности соответствует 2,5x10 КОЕ/мл. В лунки 96-луночного плоскодонного планшета вносили исследуемые вещества (ареницин + сыворотка крови кролика, или ареницин + лизоцим), растворенные в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4 (конечная концентрация буфера — 5 мМ). Объем пробы составлял 100 мкл, концентрацию рассчитывали на конечный объем пробы (200 мкл). Контрольные пробы содержали 100 мкл буфера. Вторым контролем (на стерильность условий) служили лунки, содержащие буфер, питательную среду и ресазурин.
Выделение и очистка ареницинов
Схема выделения антимикробных пептидов из целомоцитов пескожила состояла из последовательного применения традиционных подходов, используемых в препаративной химии катионных антимикробных пептидов. Мы исключили стадию ультрафильтрации т.к. обнаружилось, что выход низкомолекулярных фракций слишком мал, видимо из-за тенденции пептидов к агрегации (скорее всего, за счет гидрофобных взаимодействий). В каждом последующем этапе очистки участвовали только фракции, обладающие антимикробной активностью.
Применение ОФ ВЭЖХ на заключительной стадии очистки позволяло получить очищенные препараты пептидов с высокой степенью гомогенности, что подтверждалось с помощью ЭФ в ПААГ и масс-спектрометрических исследований.
Надо отметить, что опыты по выделению ареницинов проводились многократно (на материале разных лет), т.к. для проведения различных исследований физико-химических и функциональных свойств требовалось большое количество препарата. При этом, каждый раз, в результате использования приведенной схемы очистки, на выходе удавалось выделить пептиды с такими же свойствами (молекулярная масса, подвижность в ПААГ в присутствии мочевины, элюция с колонки ВЭЖХ при одинаковом проценте ацетонитрила, высокая активность против трех микробов, присутствие дисульфидных связей). Это может свидетельствовать о том, что экспрессия данных пептидов является конститутивной, по крайней мере, на данном этапе жизненного цикла животных, и, по-видимому, является важным компонентом защиты организма от инфекции. Оба пептида состоят из 21 аминокислотного остатка и отличаются друг от друга всего лишь одной консервативной заменой в 10-ом положении валина на изолейцин Структуры содержат 9 гидрофобных аминокислотных остатков (2 триптофана, 5 (4) валина, 1 аланин и 1(2) изолейцин(а), гидрофобность молекулы 43%), и 6 положительно заряженных аминокислотных остатков, представленных аргинином (Рис. 53). Характер расположения этих остатков придает молекулам ареницинов амфипатические свойства. Суммарный положительный заряд молекулы равен +6 , а расчетная изоэлектрическая точка соответствует pi 10.9.
В 3 и в 20 положении находятся два остатка цистеина, образующие дисульфидную связь. Молекула, таким образом, оказывается замкнутой в кольцо. Для подтверждения данных белкового сиквенса был применен молекулярно-биологический подход. Работа проводилась Баландиным С.В, Маркеловым М.Л., Фроловой Е.И., Леоновой Ю.Ф. и Тагаевым А.А. в Научно-Учебном Центре Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Москва) /и, руководством к. х. н. Т. В. ОВЧИННИКОВОЙ. ИЗ целомоцитов пескожила (использовались ( целомоциты от одного животного) была выделена тотальная РНК. Далее для определения структуры 3 и 5 концов кДНК использовалась процедура RT-PCR. После клонирования продуктов PCR была получена и секвенирована кДНК для обоих пептидов (Ac. Nos.: AY684856, AY684857) (Ovchinnikova et al., 2004). Определение нуклеотидной последовательности гена показало, что он представлен открытой рамкой считывания из 609 пар оснований, кодирующей предшественник ареницина из 202 аминокислот. Расшифровка нуклеотидной последовательности кДНК полностью подтвердила последовательность зрелого пептида, определенную по методу Эдмана (Рис.52). Кроме замены Вал на Иле в молекуле зрелого пептида, в последовательности предшественника присутствует всего 12 других нуклеотидных замен, ведущих к 6 дополнительным аминокислотным заменам в структуре предшественника. 5 UTR и транслируемые участки гена у двух изоформ имеют примерно 98.5% гомологию. Молекулярно-биологические исследования показали, что ареницины являются истинными ген-кодируемыми пептидами. Продукт гена каждого из ареницинов представляет собой большой предшественник (202 аминокислотных остатка), состоящий из сигнальной последовательности, проучастка и зрелого пептида. Результаты анализа последовательности с помощью программы Signal IP (http://www.cbs.dtxi.dk/services/SignalP) указали на Цис25-Асп26, как наиболее вероятный сайт расщепления для эукариотических сигнальных пептидаз. Обращает на себя внимание большой размер пропоследовательности ареницина (больше 150 аминокислот), пропоследовательности многих пептидов гораздо короче, обычно они состоят из 30-50 аминокислот. Предполагается, что функция предшественника заключается в маскировании молекулы зрелого пептида, потенциально токсичной для клетки. Из известных на сегодняшний день пептидов только группа кателицидинов характеризуется сопоставимым по размеру предшественником (112 аминокислот), для которого не исключается возможность выполнения собственной функции (Zaiou,Gallo, 2002). Анализ пропоследовательности с помощью поисковой системы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) выявил, что участок с 75 по 175 имеет гомологию (35.7%) с т.н. BRICHOS доменом. Этот домен (около 100 а.к.) был впервые описан (Sanchez-Pulido et al., 2002) у ранее не связываемых друг с другом белков человека, мутации которых сопряжены с некоторыми тяжелыми заболеваниями: ВЫг (дементия), ChM-ICAll (хондросаркома), САП (рак желудка) и SP-C (респираторный дисстресс) (из названий перечисленных белков и складывается аббревиатура BRICHOS) . BRICHOS домен обнаруживается в составе предшественников этих белков, и затем удаляется в ходе процессинга, который осуществляется протеиназами семейства фуринов. Сейчас в базе данных содержатся последовательности 271-го белка, имеющих подобный домен в составе своего предшественника (и в их числе нет ни одного другого предшественника антимикробного пептида). Среди них есть белки принадлежащие филогенитически далеким друг от друга видам, таким как: Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, Gallus gallus, Homo sapiens, что говорит об очень древнем происхождении этого домена. BRICHOS домен содержит в своем составе 2 консервативных цистеина, которые скорее всего замыкают дисульфидную связь, о чем свидетельствуют данные о фолдинге SP-C белка, а также то, что наиболее консервативные блоки последовательности находятся рядом с этими цистеинами. Дальнейшее изучение BRICHOS домена привело к заключению о том, что его структура напоминает апикальный или полипептид-распознающий домен GroEL (Sanchez-Pulido et al., 2002). Основываясь на свойствах белков, которые содержат BRICHOS, авторы определили его функции: он способствует правильной доставке молекулы на секреторный путь, обеспечивает правильный протеолитический процессинг и выступает в роли внутримолекулярного шаперона. Анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей зрелого пептида с помощью поисковой системы BLAST не выявил какой-либо значительной гомологии с имеющимися в базах данных белковыми и нуклеотидными последовательностями. Ареницины можно отнести к группе пептидов с 1 дисульфидной связью (См. Обзор литературы, стр.23-24). В составе этой группы описаны многочисленные пептиды из кожи земноводных (в основном лягушек), которые, возможно, эволюционно родственны друг другу, т.к. характеризуются общей структурой, построенной по принципу лассо (имеют длинный N-терминальный линейный хвост и небольшое 6-членное кольцо на С-конце (Rana box)). К этой же относится танатин, выделенный из Podisus maculiventris (oTp.Hemiptera) (Fehlbaum et al., 1996), формирующий 8-членное кольцо (insect box). Ранее к пептидам с одной дисульфидной связью относили и состоящий из 12 аминокислот додекапептид (бактенецин) из нейтрофилов быка (Romeo et al.,1988), но недавно было установлено, что в нативной форме он существует в виде димера с двумя межмолекулярными дисульфидными мостиками (Gennaro, Zanetti, 2000). Кольцевую структуру имеет тигеренин (Sai et al., 2001), недавно выделенный из кожи лягушек Rana tigerina, его молекула образует 9-членное кольцо, однако он состоит всего из 11-аминокислот и содержит в структуре только один основный аминокислотный остаток.
Выделение, очистка и определение первичной структуры ареницинов
Огромное количество данных свидетельствует, что в основе бактерицидного действия антимикробных пептидов лежит их взаимодействие с цитоплазматической мембраной. Тем не менее, поскольку ареницин - это совершенно новый, неизученный пептид, экспериментальная проверка таких предположений является необходимой. В процессе изучения механизма действия антимикробных пептидов было разработано множество методических подходов для изучения взаимодействия пептидов с бактериальной клеткой и искусственными мембранами. Несмотря на то, что метод исследования проницаемости наружной и внутренней (цитоплазматической) мембран Escherichia coli ML-35p под воздействием пептидов был предложен Робертом Лерером еще в 1988 г. (Lehrer et al., 1988), он до сих пор широко применяется исследователями во всем мире. Полное представление о механизме действия того или иного пептида можно получить, конечно, только после сопоставления данных, полученных разными методами, однако, в рамках изучения основных функциональных свойств, присущих ареницину, важно было продемонстрировать его способность повреждать внутреннюю мембрану бактерии.
Полученные нами данные свидетельствуют о ярко выраженной способности ареницина к увеличению проницаемости цитоплазматической мембраны E.coli, при этом скорость процесса почти не зависит от концентрации пептида и только незначительно замедляется при минимальной тестируемой концентрации 0.5 мкг/мл (0.2 мкМ), что составляет 0.36 МИК.
В работах выполненных под руководством одного из ведущих специалистов в области изучения механизма действия антимикробных пептидов Р. Хэнкока большое внимание уделяется взаимосвязи между минимальной ингибирующей концентрацией пептида и наблюдаемым при воздействии этой концентрации эффектом. При этом Хэнкок неоднакратно приводит примеры (Wu et al., 1999; Zhang et al., 2001; Hanckok, Rozek, 2002), когда гибель клетки от воздействия пептида при его МИК связана не с эффектом повреждения мембраны, а скорее с ингибированием внутриклеточных процессов (синтеза ДНК, РНК или белка). Достаточное же для гибели клетки увеличение проницаемости мембраны проявляется лишь при увеличении концентрации пептида в несколько раз.
В случае ареницина его влияние на проницаемость цитоплазматической мембраны бактерии проявляется уже при 0.4 МИК, а зависимость количества жизнеспособных колониеобразующих элементов от времени инкубации с пептидом коррелирует с кинетикой повреждения внутренней мембраны, что говорит о том, что, скорее всего именно процесс увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны является причиной гибели бактериальной клетки при воздействии ареницина. Важной функциональной характеристикой ареницина, которую необходимо подчеркнуть, является скорость, с которой он убивает бактериальные клетки. Уже через пять минут после начала инкубации с бактерией количество жизнеспособных клеток уменьшается на 3 порядка, а через 10 минут таких клеток практически не остается. Для того чтобы вступить во взаимодействие с внутренней мембраной грамотрицательной бактерии пептиду необходимо преодолеть внешнюю липополисахаридную мембрану. Внешняя мембрана} являясь первым барьером между клеткой и средой, препятствует проникновению в клетку крупных молекул и тем самым определяет устойчивость бактерий ко многим воздействиям: антибиотикам (актиномицину Д), ферментам (лизоциму), красителям, детергентам. В состав внешней мембраны грам-отрицательных бактерий входят белки-порины, которые способны пропускать в периплазматическое пространство гидрофильные молекулы с массой не более 600-700 Да (по Громову, 1985). При нарушении целостности внешней мембраны под воздействием какого-либо агента она становится проницаема для перечисленных веществ. Этот феномен используется для оценки способности антимикробных пептидов к повреждению внешней мембраны. В наших экспериментах, при добавлении в начале опыта в инкубационную среду с пептидом сильного детергента (Тритона Х-100), наблюдалось резкое возрастание
138 скорости увеличения проницаемости цитоплазматической мембраны (См. Результаты, рис. 46), при этом добавление детергента к бактерии в отсутствие пептида не вызывало никакого эффекта. Это является свидетельством повреждающего воздействия ареницина также и на наружную мембрану бактерии, причем, разрушение наружной оболочки бактерии, видимо, происходит через стадию образования гидрофобных пор, облегчающих доступ детергента к собственно плазматической мембране.
Исследователи в области изучения взаимосвязи структуры и механизма действия антимикробных пептидов часто приходят к выводу, что каждому пептиду свойственен свой собственный, уникальный механизм действия, однако это не мешает предполагать, что пептиды с похожими структурными свойствами будут действовать аналогично. Сравнение кинетики изменения проницаемости под действием разных пептидов свидетельствует о стереотипности механизмов действия большинства антимикробных пептидов, к какому бы структурному классу они не принадлежали. Все пептиды способны к более или менее быстрому увеличению проницаемости цитоплазматической мембраны E.coli. Отличия заключаются в длительности лаг-периода и скорости изменения проницаемости. Лаг-период перед началом процесса пермеализации, свойственный всем протестированным пептидам, соответствует, видимо, стадии аккумуляции пептида на поверхности мембраны до достижения пороговой концентрации, необходимой для дальнейшего разрушительного действия (см. Обзор литературы, стр.39). Дальнейшее изменение проницаемости связано с механизмом взаимодействия каждого пептида с мембраной, а, следовательно, различия и сходства таких взаимодействий отражаются в параметрах кривой проницаемости. Наиболее сходным с ареницином по характеру действия на цитоплазматическую мембрану E.coli является протегрин, что еще раз подтверждает наш е предположение о структурном сходстве между этими пептидами на уровне надпервичных структур. Исследования взаимодействия протегрина с плоскими липидными слоями (Heller et al.,2000) показали, что эффект протегрина по уменьшению толщины липидного слоя по своим параметрам совпадает с таковым аламетицина, который на сегодняшний день является практически единственным представителем пептидов, образующих структурированные поры по «barrel-stave» механизму (Не et al., 1996а). Данные полученные другой группой (Yang et al.,2000), на основании изучения кристаллизации пор в искусственных мембранах с помощью дифракции нейтронов приводят к заключению, что наиболее вероятный механизм действия этого пептида - формирование стабильных тороидных пор, аналогично магейнину (Ludtke et al., 1996) (См. Озор литературы, рис.13), но с отличной от последнего структурной организацией.
Во всяком случае, по структурным и функциональным свойствам как протегрин, так и ареницин соответствуют необходимым условиям (см. Обзор литературы, стр.40) для порообразующих пептидов.
