Введение к работе
Актуальность темы исследования. Изучение структуры макромолекул занимают центральное место в биохимических и биофизических исследованиях. Одним из основных направлений таких исследований является решение проблемы сворачивания полипептидноіі иепи белковой молекулы. Современные представления о структуре белковых молекул основываются в основном на информации, получаемой из двух независимых источников - химических исследований последовательности аминокислотных остатков в полипептидных цепях белков (первичной структуры) и кристаллографических исследований трехмерного расположения аминокислотных остатков (третичной структуры). Однако до сих пор не совсем ясно, что заставляет полипептидную цепь свернуться вполне определенным образом. Ясно только, что для понимания процесса сворачивания белка необходимо иметь информацию не только о топологии молекулы, но и о ее термодинамических параметрах. Однако термодинамические данные не могут быть однозначно выведены из структурных данных, они должны быть получены путем прямых измерений энергии дезорганизации нативной структуры белка. Это можно сделать с помощью сканирующей микрокалориметрии, созданной специально для таких целей.
Метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) позволяет изучать процесс тепловой денатурации белков, а изменения характера этого процесса отражают конформационные изменения в белковой молекуле. В последнее время этот метод все чаще применяется для регистрации и исследования структурных перестроек, происходящих в белках в результате сайт-направленного мутагенеза, специфических химических модификаций и воздействия различных низкомолекулярных лигандов. В то же время возможности применения метода ДСК еще далеко не исчерпаны. Так, например, этот перспективный подход пока еще крайне редко применяется для изучения конформационных перестроек, происходящих в белках, взаимодействующих друг с другом с образованием белковых комплексов или сложных надмолекулярных структур. На наш взгляд, применение метода ДСК предоставляет новые возможности для решения ряда задач современной физико-химической биологии, многие из которых нередко трудно решить другими методами.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы оценить возможности исследования методом ДСК конформационных изменений, происходящих в белках под влиянием различных факторов, в результате взаимодей-
ствия белков с низкомолекулярными лигандами и белок-белковых взаимодействий. Среди задач исследования можно выделить следующие:
исследование механизма необратимой тепловой денатурации креатинкиназы из скелетных мышц кролика и уридинфосфорилазы из Е, coli К-12 с кинетическим анализом данных.
исследование влияния кофактора на характер тепловой денатурации альдегид-дегидрогеназ на примере фосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидро-геказы из Bacillus stearothermophilus (GAPD) и нефосфорклирующей D-глицер-альдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPN) из Streptococcus mutans.
исследование влияния пяридоксальфосфата (ПЛФ) и различных специфических лигандов - как активаторов, так и ингибиторов, на характер тепловой денатурации гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика.
изучение структурных изменений, происходящих в изолированной головке молекулы миозина (субфрагмент-1 миозина, S1) при образовании комплексов с аналогами неорганического фосфата, моделирующих различные промежуточные состояния АГРазной реакции миозина.
-изучение влияния на тепловую денатурацию тропомиозина и субфрагмента-1 миозина (S1) их взаимодействия с другим мушечным белком - F-ахтином.
- сравнительное исследование целых вирусов табачной мозаики и белка, образую
щего вирусную оболочку.
Научная новизна. Впервые получены данные по тепловой денатурации ряда ферментов, ранее не исследовавшихся методом ДСК - креатинкиназы и гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и уридинфосфорилазы из Е. coli К-12. Предложены модели, оаисывающие механизм этого процесса с оценкой кинетических параметров отдельных стадий.
Впервые методом ДСК изучено влияние кофактора на тепловую денатурацию фосфорилирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из Bacillus stearothermophilus и нефосфорклирующей D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из Streptococcus mutans. Исследовано влияние различных точечных мутаций на термостабильность этих ферментов в отсутствие и в присутствии кофактора. Показано, что связывание кофактора вызывает значительные структурные перестройки в молекуле
фермента, изменяя характер взаимодействий между его каталитическим и кофактор-связывающим доменами.
Показано, что метод ДСК позволяет отчетливо регистрировать структурные изменения, происходящие в изолированной головке молекулы миозина при моделировании различных промежуточных состояний АТРазной реакции миозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест для анализа конформа-ционных изменений, происходящих в миозиновых головках в процессе АТРазной реакции.
Метод ДСК был впервые применен для изучения комплексов F-актина из скелетных мышц кролика с другими мышечными белками - тропомиозином и изолированными головками миозина (субфрагмент-1 миозина, S1). Показано, что взаимодействие с F-актином значительно увеличивает термостабильность данных белков, причем связывание S1 с F-актином заметно увеличивает термостабильность связанного с F-актином тропомиозина. На основании этих данных предложен новый калориметрический тест для анализа конформационных перестроек, происходящих в миозиновых головках и в тропомиозине при их взаимодействий с филаментами F-актина.
С помощью метода ДСК проведено сравнительное исследование целых вирусов табачной мозаики и белка, образующего вирусную оболочку. Показано, что полимеризация белка оболочки приводит к резкому увеличению его термостабильности, а взаимодействие этого белка с вирусной РНК приводит к дополнительной стабилизации структуры вируса.
Теоретическая и практическая ценность. Решение поставленных в диссертационной работе задач позволило разработать новые методические подходы и представить ряд практических рекомендаций, полезных при исследовании методом ДСК сложных комплексных систем. Созданы необходимые предпосылки для дальнейших исследований методом ДСК комплексов различных белков с низкомолекулярными лигандами и с другими белками. Помимо этого, разработано программное обеспечение для компьютерной записи и первичной обработки калориметрических данных, которое в настоящее время успешно используется в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 25-м Европейском Мышечном Конгрессе (Монпелье, Франция, 1996), на Втором съезде Биохимического Общества (Москва, 1997), на Международном симпозиуме «Структура, стабильность и фолдинг белков: фундаментальные и медицинские
аспекты» (Москва, 1998), на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: современные методы исследований» (Пущино, 1998), на 43-м Конгрессе американского биофизического общества (Балтимор, США, 1999), на 28-м Европейском Мышечном Конгрессе (Йорк, Великобритания, 1999), на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), на Российско-Итальянском рабочем совещании IRCAW-99 «Новые достижения в калориметрии и их применение», (Италия, 1999) и на Гордоновской научной конференции «Мышца: сократительные белки» (Ныо Лондон, США, 1999).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их
