Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ЧАСТЬ I. Обзор литературы
Глава I. СОРБИТОЛОВЫИ IFTb OHvIEHA ГЛЮКОЗЫ ПРИ ЭКСПЕРИ МЕНТАЛЬНО М ДИАБЕТЕ 13
Глава II. НЕКОТОРЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ И ФАРІШЮЛОГЙЧЕСКИЕ &ЖТЫ ВИТАМИНА РР 32
ЧАСТЬ II. Экспериментальная часть
Глава III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 48
Глава ІУ. СОРБИТОЛОВЫИ ПУТЬ ОБМЕНА ГЛЮШЗЫ ПРИ СТРЕПЮ 30Т0ДИН0В0М ДИАБЕТЕ РАЗНОЙ ДЛИТЕЛЬНОСТИ И ТЯЖЕСТИ. ДЕЙСТВИЕ НИЮТИНАІЩА 64
Глава У. ГИШГЛИШЛИЧЕСКИЙ Ш ЕКТ НИШТИНАМИДА ПРИ СТРЕПТОЭОТОЩНОВОМ ДИАБЕТЕ 80
Глава УІ. ИЗМЕНЕНИЕ ШДЕРЖАНИЯ И ОТНОШЕНИЯ ОКИСЛЕННЫХ И ВОССТАНОВЛЕННЫХ ФОРМ НШЮТИНАМИДНЫХ ШФЕР МЕНТОВ ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦЙНОВОМ ДИАБЕТЕ И ВВЕДЕНИИ НИЮ ТИНАМИДА 87
Глава УІІ. АКТИВНОСТЬ НЕКОТОРЫХ ЗШР -ЗАВИСИМЫХ ДЕ ГИДЮГЕНАЗ В СВОБОДНО ПРОНИЦАЕМЫХ ДЛЯ ГЛЮШЗЫ ТКАНЯХ ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦЙНОВОМ ДИАБЕТЕ И ВВЕДЕНИИ ЕШТИНАМИДА. 100
Глава УІІІ. КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПРЯІОЙ СОРБИТОЛДЕ-ГИДРОГЕНАЗНОЙ РЕАКЦИИ И ИХ РЕГУЛЯЦИЯ ОТНО ШЕНИЕМ HAD+/NADH 108
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 115
ВЫВОДЫ 127
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 129
Введение к работе
Актуальность проблемы По данным экспертов Всемирной Организации Здравоохранения, развитие хронических диабетических поражений является главной причиной инвалидности и смертности больных сахарным диабетом. Шиск терапевтических средств для профилактики и лечения диабетических ангио-, нефро-, полинейропатии и катаракты составляет одну из основных задач современной эндокринологии.
По мнению ряда ведущих диабетологов /22,110,177/, одним из возможных механизмов в патогенезе хронических диабетических поражений является переключение потока глюкозы с метаболических процессов, чувствительных к инсулину, на таковые, интенсивность которых не зависит от концентрации данного гормона в крови /69,70/. Так, активация биосинтеза мукополиса-харидов и предшественников гликопротеидов из глюкозы при диабете способствует развитию почечного гломерулосклероза /72, 210/ и ретинопатии /203/, а возрастание скорости восстановления глюкозы в сорбитол с последующим накоплением его в тканях играет роль в патогенезе катаракты /223/, полинейропатии /89/, а, возможно, также макро- и микроангиопатии /22,177/.
С целью направленной регуляции содержания сорбитола в тканях при диабете в течение последних 10 лет в ряде научных лабораторий проводится синтез и испытание ингибиторов альдо-зоредуктазы / L - альдитол: NADP І - оксидоредуктаза, КФ І.І.І.2І/ - фермента, катализирующего восстановление глюкозы в сорбитол. В настоящее время известно свыше ста таких соединений. Однако, ни одно из них не нашло широкого клинического применения вследствие высокой токсичности, нежелательных системных эффектов, наличия канцерогенных и мутагенных свойств /223/. Все это ставит под сомнение оправданность такого рода подходов /78/ и побуждает искать другие, более физиологические пути регуляции обмена сорбитола при диабете.
Поскольку сорбитоловый путь обмена глюкозы включает две дегидрогеназные реакции - альдозоредуктазную и сорбитолдегид-рогеназную / L-идитол: NAD 5-оксидоредуктаза, КФ 1.1,1,11/, то активность этих ферментов и, возможно, их биосинтез находятся под метаболическим контролем со стороны низкомолекулярных соединений - витамина РР и никотинамидных коферментов. Следовательно, знание механизма такой регуляции позволило бы целенаправленно воздействовать на содержание сорбитола в тканях при диабете путем коррекции регуляторних факторов с помощью соединений естественного происхождения. По этой причине изучение роли никотинамидных коферментов в регуляции сорбито-лового пути обмена глюкозы при диабете представляется весьма актуальным в медико-биологическом аспекте.
К настоящему времени в изучении витамина РР / никотиновой кислоты и никотинамида/, важного представителя водорастворимых витаминов, достигнуты существенные успехи /4,10,60/. Расшифрована его основная функциональная роль в реакциях биологической оксидоредукции, реализующаяся посредством широко распространенных никотинамидных коферментов - никотинамидаденин-динуклеотида / NAD / и никотинащцадениндинуклеотидфосфата / UADP /, исследованы механизмы действия последних как коферментов в дегидрогеназном катализе /148/. Открыт также ряд других, некоферментных функций никотинамида и HAD . Так, показано, что никотинамвд и N -метилникотинамид участвуют в процессах метилирования т-РНК и белков /150/, a HAD является аллостерическим эффектором в регуляции активности ключевых ферментов энергетического обмена /98,208/, компонентом ДНК-лигазной реакции /241/, модулятором нейросинаптической передачи /55,196/, субстратом в синтезе биополимера / поли-ADP /рибозы, который, соединяясь с акцепторными ядерными белками, регулирует синтез и репликацию ДЖ /53,129/, а такке стимулятором биосинтеза инсулина /188/.
Работы по изучению механизмов обмена витамина РР привели к получению экспериментальных доказательств существования трёх альтернативных путей биосинтеза никотинамидных кофермен-тов в тканях животных из никотиновой кислоты, никотинамида и триптофана /44,54/.
При исследовании широкого спектра метаболических эффектов витамина РР при диабете был выявлен ряд благоприятных моментов. Так, введение никотиновой кислоты и никотинамида приводит к снижению уровня глюкозы в крови животных с аллоксановым диабетом /12/ и больных сахарным диабетом /29,43/, а также оказывает выраженный ингибирующий эффект на процессы липолиза и кетогенеза /126/. Введение витамина РР животным с аллоксановым диабетом сопровождается активацией окисления глюкозы по гликолитическому пути и ингибированием глюконеогенеза в печени /12/, усиление которого является одншл из факторов прогрес-сирования диабетической гипергликемии /170/.
Эти факты находят своё объяснение в рамках следующей гипотезы. Известно, что в процессах дихотомического и апотоми-ческого окисления глюкозы, а также её биосинтеза de novo из -неуглеводных предшественников значительную роль играют NAD-и HADP -зависимые дегидрогеназы. Нацравление протекания реакций, катализируемых этими ферментами, определяется окислительно-восстановительным состоянием свободных NAD- И NADP-nap, которое выражается через отношения NADVNADH и NADP+/NADPH. Для ряда тканей диабетических животных характерно снижение этого показателя, что ведёт к повышению восстановительных свойств NAD - и NADP-пар цитоплазмы клеток /12,152,224/. Введение в организм животных никотиновой кислоты вызывает усиленный биосинтез HAD с одновременным повышением его содержания при менее выраженном росте НАШ /44/, и, вследствие этого, сдвиг окислительно-восстановительного СОСТОЯНИЯ NAD -пары в сторону большей окисленности. В итоге усиливается окисление глюкозы в печени и угнетается её биосинтез de novo из неуглеводных предшественников в глюконеогенезе /12/.
Имеются данные /163/, свидетельствующие о том, что ряд эффектов никотиновой кислоты и никотинамида на углеводный и липидный обмен сходны. Однако, предварительное введение никотинамида защищает животных от диабетогенного действия стреп-тозотоцина и аллоксана, в то время как никотиновая кислота и триптофан - другие предшественники никотинамидных коферментов, не аккумулируются в бета-клетках в значительной степени и не обладают подобным эффектом /165/. Это объясняется сильным ин-гибирующим действием никотинамида / но не никотиновой кислоты/ на /поли-ADP/рибозосинтетазу бета-клеток/238/, активность которой повышена при экспериментальном диабете, что сопровождается уменьшением содержания NAD В островках и ингибирова-нием биосинтеза проинсулина на стадии трансляции /188/. Введе ниє никотинамида в течение месяца мышам со спонтанным диабетом приводило к полному восстановлению нормальной толерантности к углеводам /237/. Рядом авторов /221,237/ сделано предположение об обратимости развития поражений бета-клеток на ранних этапах инсулин-зависимого диабета и о возможности применения никотинамида для их коррекции.
По нашему мнению, никотинамид обладает и рядом других преимуществ, по сравнению с никотиновой кислотой. Во-первых, никотинамид, в отличие от никотиновой кислоты, не обладает сосудорасширяющим эффектом, который может отрицательно сказываться на состоянии организма при введении больших доз препарата. Во-вторых, изучение фармакокинетических свойств никотинамида показало, что никотинамид при введении в организм быстрее и полнее проникает в клетки тканей и превращается в никотинамидные коферменты.
В настоящее время препараты, в состав которых входит никотиновая кислота / нигекеин, компламин, ксавин, никоверин/, успешно применяются в клинике в качестве сосудорасширяющих и желчегонных /никодин/ средств. Кроме того, никотиновая кислота и никотинамид в комплексе с другими витаминами широко используются при лечении гиповитаминозов, возникающих при ряде патологических состояний, в том числе, и при диабете, Однако, теоретические основы для применения никотинамида в комплексной терапии хронических диабетических поражений практически не разработаны.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение регуляции сорбитолового пути обмена глюкозы на уровне метаболитов и кофакторов, её нарушений при экспериментальном диабете, а также оценка возможности применения никотинамида для коррекции наблюдаемых патологических изменений.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
I/ на основании определения концентрации метаболитов, а также альдозоредуктазной и сорбитолдегидрогеназной активности, изучить сорбитоловый путь обмена глюкозы у животных с экспериментальным диабетом, а также действие никотинамида на этот процесс;
2/ изучить на выделенном ферменте кинетические параметры сорбитолдегидрогеназной реакции и их регуляцию окислительно-восстановительным состоянием HAD -пар;
3/ используя определение концентрации метаболитов лак-татдегидрогеназной и малатдегидрогеназной /декарбоксилирую-щей оксалоацетат/ / HADP+ / систем и расчеты отношений свободных UAD+/NADH и NADPVNADPH для цитоплазмы клеток по уравнению действующих масс, оценить изменения окислительно-восстановительного состояния свободных никотинамидных кофер-ментов при диабете и введении никотинамида;
4/ определяя содержание глюкозы в крови и активность ферментов глюконеогенеза в печени экспериментальных животных, изучить гипогликемический эффект никотинамида при стрептозо-тоциновом диабете;
5/ на основании определения содержания никотинамидных ко-ферментов, а также активности некоторых HADP -зависимых де-гидрогеназ, изучить влияние никотинамида на генерацию восстановительного эквивалента в виде HADPH / кофактора альдозоредуктазной реакции/.
Научная новизна. На защиту выносятся следующие новые научные положения:
I/ интенсификация биосинтеза и ингибирование окисления сорбитола при стрептозотоциновом диабете сопровождаются накоплением метаболитов сорбитолового пути обмена глюкозы в тканях. Степень накопления сорбитола и фруктозы определяется длительностью и тяжестью диабета;
2/ никотинамид снижает содержание сорбитола в тканях животных со стрептозотоциновым диабетом путем угнетения его биосинтеза в альдозоредуктазной и активации окисления в сор-битолдегидрогеназной реакции;
2/ возможными путями действия никотинамида на обмен сорбитола являются изменение содержания кофакторов альдозоредуктазной и сорбитолдегидрогеназной реакций, сдвиг окислительно-восстановительного состояния HAD - и NADP -пар в сторону повышения окислительных свойств, а также гипогликемический эффект, сопровождающийся снижением уровня глюкозы в тканях;
4/ кинетические параметры прямой сорбитолдегидрогеназной реакции определяются отношением NAD+/ НАШ , причём NADH является её конкурентным ингибитором в отношении NAD+.
Практическое значение. Полученные в настоящей работе данные могут служить теоретической основой для клинических испытаний никотинамида в качестве средства для профилактики и лечения хронических диабетических поражений и определяют актуальность поиска новых препаратов витамина РР с пролонгированным действием. ж ж « Изложенные в настоящей работе данные являются фрагментом -плановых исследований, проводимых в диабетологическом отделе Киевского научно-исследовательского института эндокринологии и обмена веществ МЗ УССР под руководством член-корреспондента АМН СССР, доктора медицинских наук, профессора А.С.Ефимова по изучению патогенеза и разработке методов диагностики, профилактики и лечения хронических диабетических поражений. Руководство всеми разделами работы осуществлялось также старшим научным сотрудником отдела биохимии коферментов Института биохимии им.А.В.Палладина АН УССР, кандидатом биологических наук Н.Н.Великим.
