Введение к работе
- 1 -
Актуальность проблемы. Грибы, разрушающие древесину, секре-тирувт окислительные лигнолитические фермента, окисляющие не только лигнин, но и различные стойкие загрязнители окружающей среды. Поэтому их можно использовать для решения широкого круга экологических и биотехнологических задач в промышленности, сельском хозяйстве и здравоохранении. Конечные прикладные цели здесь могут быть самыми разными - от направленного конструирования организмов-деструкторов до создания искусственных детоксицирушцих систем, своего рода протезов печени, обезвреживающих ксенобиотики. С точки зрения энзимологии особенно ванно понять, какие специфические особенности структуры и механизма действия лигнолити-ческих ферментов обусловливают их эффективность.
Среди лигнолитических ферментов наибольшей окисляющей способностью, по-видимому, обладают гемсодеряащиэ лигнинпероксидазы (лигниназы), секретируемые грибом Fhanerocbaete chrysoavorixm. Все, что в настоящее время известно о лигниназах, настолько подчеркивает их сходство с другими гемсодеркащими пероксидазами, что естествен вопрос, чем ке отличаются от них лигниназы? Особое внимание привлекают следующие две проблемы. Во-первых, лигниназы окисляют лигнин и его синтетические аналоги лишь в кислых средах, причем эта активность возрастает с понижением рН вплоть до -2-3. Неясно, является ли это уникальным свойством лигниназ, или в какой-то мере присуще и другим гемсодеряащим пероксидазам, которые, будучи более доступными, могли бы стать моделями для изучения ;'-;,л,лды денного феномена. Во-вторых, как для понимания биологического с:::о;п поли.:ор^.!зма лигнэтаз, так и для их прикладного ис-я'>льзое?!л:я необходимо тяуггпъ пртїч:пм различий в субстратной
-2^
специфичности разных изоформ лигшшаз и других пероксидаз при окислении лигншюподобных соэдинений. Для этого целесообразно сравнить кинетику и спектр продуктов окисления различных аналогов лигнина пзроксидазами и химическими одноэлвктронными окислителями, геяерирующшэ, как и пероксидазы, катион-радикалы субстратов. В отсутствие фэрыента направление и скорость превращений катион-радикалов зависят лишь от внутренне присущих ш свойств. Только зная эти свойства моїшо выявить и изучить влияние форманта на судьбу связанных на нем интермоднатов окисления и, тем сакам, определить его роль на всех этапах окислительного процесса.
Цель работи - найгн подхода к изучению каталитических особенностей грибных лнгьигаз, основанные на их моделировании как геысодерзеащиш пероксидазааи растительного и животного происхождения, так и химическими одвоэлектровшши ОКИСЛИТЄЛЯі.іИ.
Для достижения этой цели были поставлены следувзлз 2&іЧ&ї 1). Установить, существуют ли условия, в которых неспецифа-ческие пероксидазы способны окислять нефонольные аналоги лигнина - типичные субстраты лигниназ;
2). В даннзл условиях сравнить каталитические свойства этих пероксидаз с известными свойствами лигшшаз (рН-зависимость каталитической активности, действие ингибиторов и промоторов, субстратная специфичность и т.д.);
3). Выявить факторы, опрэдёлящие ропюспецифпчность фэрмон-тативного и химического окисления аналогов лигнина.
Научяэя новизна и практическая значимость работы. Показано, что генсодэряащка пороксидазы растительного и іаівогкого происхождения в кислой ерзде способны оіаслять
нефзнольные аналога лигнина, ранее считавшиеся доступными только для специфических грибных лигниназ.
Установлено, что вклад окислительно-гидролитического деалки-лирования мояот служить показателем стабильности субстратных катион-радикалов и их экранирования в активно?! центре фермента.
Предложены новые тестовые субстраты, позволяющие классифицировать окислительные лигнолитические ферменты по их способности влиять на скорость и направление превращений прсмеЕсуточных субстратных катион-радикалов.
Разработан простой и эффективный метод очистки и разделения на изофорш сырых препаратов пероксидазы из хрена.
Апробация работы состоялась 27-11-91 на совместной научной конференции лабораторий физико-химических методов анализа, микро-сомального окисления, использования вычислительной техники в биохимии Института биологической и медицинской химии АМН СССР, кафедры бяохимяи МВФ и ПНИЛ экологии, токсикология и метаболизма лекарственных прэпарзтов 2-го МОЛИШ им. Н.ії. Пирогова. Результаты исследований докладывались на Всесоизных конференциях гЦитохром Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987), "Цитохром Р-450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989) и на 2-ой Международной школе по биотехнологии (Тарту, 1991).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 160 страницах, включая 25 рисунков, 12 схем и 16 таблиц, и состоит из введения, глав: "Обзор літератури", "Материалы и метода исследований", "Результаты и обсуждение", выводов и списка цитируемой литературы (252 ссылки).
