Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
1.1. Современные представления о структуре эритроцитарной мембраны 10
1.2. Организация белков в мембране эритроцитов 13
1.2.1. Белки цитоскелетного комплекса .... 17
1.2.2. Интегральные белки 20
1.2.3. Гликопротеиды .,...;...".*-., 24
1.3. Дифференциация:и старение эритроцитов 29
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 37
2.1. Фракционирование эритроцитов 37
2.2. Получение мембранных препаратов, определение белка 38
2.3. Бутанольный метод экстракции мембранных белков эритроцитов 40
2.4. Электрофорез мембранных белков 40
2.4.1. Приготовление образца 41
2.4.2. Приготовление геля 41
2.4.3. Проведение электрофореза 42
2.5. Окраска белков 42
2.6. Окраска гликопротеидов 43
2.7. Сканирование гелей 43
2.8. Определение активности Мо-АТФазы .... 44
2.9. Определение активности Na-K-АТФазы .. 44
2.10. Определение активности HCOg-АТФазы . 44
2.11. Метод иммунных эритрограмм 45
2.12. Получение антиэритроцитарной сыворотки крови морских свинок против кроличьих эритроцитов 46
2.13. Титрование антиэритроцитарной сыворотки крови морских свинок против кроличьих эритроцитов 46
2.14. Титрование комплемента 47
2.15. Обработка данных полученных в результате исследования гемолиза эритроцитов кролика в различных сериях опытов /фон, 7, 20, 30 сутки/ 48
2.16. Обработка данных полученных в результате исследования активности Мд-АТФазы, Na-K-АТФазы, HCOg-АТФазы в различных сериях опытов /фон, 7, 20,
30 сутки/ 50
2.17. Обработка данных полученных в резуль
тате исследования белковых фракций .. 50
ГЛАВА III. ИЗУЧЕНИЕ ГЛИКОПРОТЕЩрВ ПРИ СТАРЕНИИ ЭРИ
ТРОЦИТОВ, ПГОДУЦИРОВАННЬК В УСЛОВИЯХ НОР
МАЛЬНОГО ЭРИГРОПОЭЗА 51
3.1. Гликопротеидиый спектр 51
3.2. Исследование иммунной стойкости при старении эритроцитов 53
3.3. Характеристика белкового спектра 59
3.4. Изучение активности HCOg-АТФазы 65
3.5. Изучение активности Мо-АТФазы 66
3.6. Изучение активности Na-K-АТФазы 67
ГЛАВА ІV. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛИКОПГОТЕИДрВ ОБЩЕЙ ЭРИТГО-
ЦИТАРНОЙ МССЫ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ НАПРЯ
ЖЕННОГО ЭРИТРОПОЭЗА 71
4.1. Гликопротеидный спектр 71
4.2. Исследование иммунной стойкости 73
4.3. Белковый спектр 76
4.4. Активность НС03-АТФазы и Мд-АТФазы .. 79
ГЛАВА V ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛИКОПГОТЕИДрВ ОБЩЕЙ ЭРИТГО-
ЦИТАРНОЙ МССЫ В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ НАПРЯ
ЖЕННОГО ЭРИТРОПОЭЗА 71
4.1. title4 Гликопротеидный спектр title5 82
5.2. Исследование иммунной стойкости 84
5.3. Белковый спектр 87
5.4. Активность НСОз~АТІазьі и Мд-АТ>азы .. 91
ГЛАВА VІ. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЛИКОПРОТЕИДОВ ВО ФРАКЦИИ
МОЛОДЫХ КЛЕТОК В РАЗЛИЧНЫЕ ПЕРИОДЫ НАПРЯ
ЖЕННОГО ЭРИТРОПОЭЗА 95
6.1. Гликопротеидный спектр 95
6.2. Исследование иммунной стойкости 97
6.3. Белковый спектр ІОІ
6.4. Активность HCOg-АТФазы и Мд-АТФазы .. 104
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108
ВЫВОДЫ И6
ЛИТЕРАТУРА П7
- Современные представления о структуре эритроцитарной мембраны
- Фракционирование эритроцитов
- Гликопротеидиый спектр
- Гликопротеидный спектр
Современные представления о структуре эритроцитарной мембраны
Согласно современным представлениям мембрана эритроцитов имеет четырехслойную структуру /рис.1/, состоящую из гликокалик-са, двух липидных слоев и слоя цитоскелетных белков /10,81,99, 102,141,177,203/.
Гликокаликс является внешним экзоплазматическим слоем, образующимся в результате взаимодействий разветвленных углеводных фрагментов гликопротеидов и гликолипидов /10,74,107,171/. Углеводные цепи гликопротеидов подвижны, поэтому гликокаликс является динамичной конструкцией; динамика углеводньк фрагментов не зависит от колебаний рН в физиологических пределах, однако, при подкислении среды резко снижается /161/. Существенное влияние на подвижность углеводных фрагментов гликокаликса оказывает рецепция гаптенов, которая снижает подвижность, но не способна устранить ее в полной мере /161/.
Гликокаликс является слоем повышенной вязкости, это обусловлено гидратацией и увеличением молекулярных размеров за счет отрицательно заряженных остатков сиаловых кислот и их асимметричного расположения /82/. Степень вязкости определяется содержанием концевых остатков фукозы и сиаловых кислот. Гликокаликс обладает значительной экранирующей способностью. Механизм процесса экранирования заключается в электростатических взаимодействиях между заряженными группами углеводов и белков /31/. Углеводные фрагменты гликокаликса играют важную роль в определении эластических свойств мембраны эритроцитов /107,185/.
Фракционирование эритроцитов
Фракционирование эритроцитов на возрастные группы основывается на различной удельной плотности молодых и старых эритроцитов. При старении плотность эритроцитов нарастает /13,17,142/.
Фракционирование осуществлялось многократным центрифугированием эритроцитов, взвешенных в физиологическом растворе, и последовательным отбором верхней и нижней части эритроцитарного столба.
После первого центрифугирования крови при ЭСОО об/мин и 4 С в течении 20 минут плазму, вместе с лейкоцитарным слоем, осторожно отбирали и отбрасывали. Последующие операции фракционирования эритроцитов проводились в физиологическом растворе. Это позволяло сочетать фракционирование с отмывкой /рис.3/.
После каждого центрифугирования верхнюю половину эритроци-тарного столба переносили в новую пробирку. Эритроциты ресуспен-дировались физиологическим раствором до 50% гематокрита и подвергались центрифугированию при тех же условиях.
Процедуру отбора верхней половины эритроцитарного столба, последующего центрифугирования повторяли четыре раза. Затем снимали 1мл эритроцитов, расположенных в верхней части эритроцитарного столба, - верхний слой - или фракция молодых клеток.
Нижние части, остающиеся после первого центрифугирования, также ресуспендируются и подвергаются фракционированию путем последовательного отбора и удаления верхней половины эритроцитарного столба, ресуспендирования и новых центрифугирований. После четвертого удаления верхней половины эритроцитарного столба, реально на дне пробирки остается 1-1,5 мл нижнего слоя - фракция старых клеток /3/.
Качество фракционирования контролировалось подсчетом-рети-кулоцитов после суправитальной окраски бриллиант-крезиловым синим.
Гликопротеидиый спектр
Изучение гликопротеидного спектра во фракции молодых эритроцитов обнаружило 12 Шифф-положительных зон /рис. 4/. Поскольку эритроциты кроликов лишены гликофорина и единственный гликопроте-ид в них - анионтранспортный белок, - все обнаруженные зоны являются его фрагментами.
Гликопротеидный спектр общей эритроцитарной массы так же является гетерогенным и представлен 12 зонами. Однако между денси-тограммами гликопротеидного спектра фракций молодых эритроцитов и общей эритроцитарной массы существуют определенные отличия: при одинаковой белковой нагрузке на гель минорные гликопротеидные зоны в области высокомолекулярных фракций в молодых клетках более выражены по сравнению с обнаруженными в мембранных препаратах клеток общей эритроцитарной массы.
Гликопротеидный спектр фракций старых эритроцитов значительно отличается от полученного во фракциях молодых эритроцитов и общей эритроцитарной массы. На электрофореграмме гликопротеидного спектра фракций старых клеток зоны размыты, без четких границ,плавно переходят друг в друга. Небольшие отличия между общей эри-троцитарной массой и фракцией молодых клеток с одной стороны, и глубокие отличия между общей эритроцитарной массой и старыми клетками с другой стороны, могут свидетельствовать о том, что нарушения углеводных компонентов гликопротеидов происходят на поздних стадиях старения клетки.
Известно, что молодые эритроциты обладают возможностью достраивать свои углеводные структуры в печени при участии печеночных гликозилтрансфераз и сиалидаз, зрелые эритроциты имеют ограниченные возможности репарации гликокаликса,- и лишь самые старые клетки утрачивают эту способность. /88-90/.
Гликопротеиды в эритроцитах кролика, характеризующиеся незначительным содержанием гликолипидов /46/, являются основными носителями антигенных детерминант. Обнаруженные изменения гликопро-теидного спектра при старении эритроцитов могут сказаться на антигенной структуре клетки. Для проверки этого предположения исследовались иммунные свойства молодых и старых эритроцитов.
Гликопротеидный спектр
На 7 сутки после острой кровопотери гликопротеидный спектр общей эритроцитарной массы /рис. 9/ представлен 10 зонами /вместо 12 у интактных кроликов/, отличающихся по своей электрофорети-ческой подвижности от гликопротеидных компонентов общей эритроцитарной массы фона. Можно предполагать, что эти различия вызваны присутствием в общей эритроцитарной массе популяции клеток, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, а также значительным повреждением мембранных гликопротеидов в период интенсивного функционирования эритроцитов при выраженном дефиците клеток в кровяном русле и гемолитической ситуации.
Исследование гликопротеидного спектра во фракции молодых эритроцитов позволит разрешить этот вопрос и будет обсуждаться ниже.
На 20 сутки после кровопотери гликопротеидный спектр общей эритроцитарной массы представлен б компонентами. Интенсивность окраски гликопротеидных компонентов на 20 сутки после кровопотери, оцененная с помощью денситограммы, значительно более выражен-на, чем у интактных кроликов, и на 7 сутки после кровопотери. Этот факт свидетельствует о присутствии в них большего количества углеводных компонентов. Поскольку на 20 сутки в кровяном русле отсутствуют эритроциты продуцированные до кровопотери /20 -22/, можно предполагать, что гликопротеидный спектр эритроцитов продуцированных при напряжении отличается от гликопротеидного спектра эритроцитов продуцированных при нормальном кроветворении.
Гликопротеидный спектр
Исследования гликопротеидного спектра во фракции старых клеток на 7 сутки после кровопотери обнаруживает его значительное изменение по сравнению с гликопротеидншл спектром этой фракции у интактных кроликов. Мембранные препараты фракций старых эритроцитов у интактных кроликов обнаруживают две протяженные гликопроте-идные зоны. На денситограмме 7 суток количество зон увеличено, часть из них по своей электрофоретической подвижности соответствует зонам общей эритроцитарной массы у интактных кроликов. В целом, денситограмма фракции старых клеток приближается к таковой в общей эритроцитарной массе у интактных кроликов /рис. 12/. Это может быть обусловлено значительным омоложением фракции старых клеток на 7 сутки после кровопотери, поскольку в условиях гемолитической ситуации наиболее старые клетки ускоренно покидают кровяное русло. На характер денситограммы определенный отпечаток может накладывать усиленное функционирование эритроцитов при дефиците клеток в кровяном русле после кровопотери.
На 20 сутки после кровопотери электрофореграмма и денситограмма фракции старых эритроцитов отличаются от полученных на сутки после кровопотери количеством зон и величиной пиков. На 20 сутки количество гликопротеидных зон увеличено по сравнению с фоном, однако, уменьшено по сравнению с количеством зон в этой фракции на 7 сутки после кровопотери. Основные гликопротеидные компоненты на 20 сутки обнаруживают электрофоретическую подвижность аналогичную подвижности основных гликопротеидных фракций у интактных кроликов. Первая гликопротеидная зона у интактных кроликов гомогенна и расплывчатая, - на электрофореграмме 20 суток она гетерогенна и подразделяется на три четких подзоны. Возможно, это обусловлено более молодым календарным возрастом эритроцитов, составляющих эту фракцию, а также более высоким содержанием углеводов в обнаруженных гликопротеидах. Это предположение оправдано, поскольку к 20 суткам эритроциты, образованные до кровопотери покидают кровяное русло. Сопоставление гликопротеидиого спектра во фракции молодых клеток на 7 сутки и во фракции старых эритроцитов на 20 сутки приводит к заключению, что недостроенные гликопротеидные компоненты эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза подвергаются достройке при циркуляции клеток в кровяном русле. Это заключение вполне оправдано, поскольку, гликопротеидные компоненты молодых эритроцитов в норме могут достраиваться гликозилтрансферазами и сиалилтрансферазами печени /88-90/.
Похожие диссертации на Изучение гликопротеидов при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза
