Введение к работе
Актуальность проблеми.
Актуальность темы определяется прежде всего тем, что состояние энергетического аппарата клеток относится к числу существенных факторов, регулирующих жизнеспособность и репарацию криоконсерви-рованных клеток [Белоус A.M. Бондаренко В.А., 1982]. Хранение клеток после цикла замораживания-оттаивания сопровождается дополнительными изменениями молекулярной структуры мембраны и клетки в целом [Белоус A.M., 1981]. Выживаемость клеток во многом зависит от темпов восстановления клеточного метаболизма и, в частности, энергетической системы клетки [Лемешко В.В., 1983]. Внутриклеточный пул макроэргических соединений, проницаемость мембраны и величины потоков субстратов следует рассматривать, как важные параметры клетки, которые можно определить методом ЯМР-спектроскопии.
Сохранность энергетических структур является необходимым условием высокого выхода клеточного материала в процессе криоконсер-вации, тем более, что при нормальном течении метаболизма клетки способны к репарации некоторых поврежденных структур [Лоевский М.М., 1985, Воротилин A.M., 1987]. Ясное представление об изменениях метаболизма на разных стадиях криоконсервирования может служить основой для научного подхода в разработке криобиологических технологий. Информация об изменениях клеточного метаболизма на стадиях введения криопротектора (КП) в клеточную систему, замораживания - оттаивания, экспозиции клеток в различных средах, представляет интерес для специалистов, занятых разработкой практических приемов криконсервирования.
В работе главное внимание уделено гликолитическому пути, в котором глюкоза транспортируется в клетку и превращается в лактат в серии из 11 реакций, катализируемых различными ферментами. Методом 31Р-ЯМР следили за изменением содеряания АГФ, 2,3-ДФГ в неразрушенных эритроцитах человека в условиях, когда клетки суспендировались в криозащитном растворе, охлаждались до температуры близкой к нулю, а затем лодвергалЕсьзамораживашш-оттаиванию. При этом предполагалось выявить те стадии процесса криоконсервирования, к которым наиболее чувствителен механизм энергообеспечения клетки. Одна из функций АТФ и 2,3-ДФГ - поддержание нормальной формы и
объема эритроцитов, о чем свидетельствует четкая корреляция между концентрацией указанных выше макроэргических соединений и морфологическими изменениями клеток В целом [Y.Suzuki, T.Nakajima, 1991]. Поэтому, одновременно с регистрацией концентрации АТФ и 2,3-ДФГ с помощью ЯМР-спектроскопии, следили за изменениями объема эритроцитов. С другой стороны в эритроцитах ферментативный процесс анаэробного превращения глюкозы служит единственным источником энергообеспечения клеток. В гликолитическом цикле нарабатывается метаболический запас макроэргических соединений - АТФ и 2,3-ДФГ, играющих ключевую роль в биоэнергетических процессах. Таким образом, изучение процессов превращения этих и других сбменоактивных форм вещества в гликолитическом пути расширяет наши знания о протекании этого сложного процесса в кивых системах, в связи с чем тема работы представляет интерес и в общебиологическом плане.
Цель и задача работы.
Целью работы явилось исследование временной зависимости содержания 2,3-ДФГ в условиях истощения по глюкозе в свежевыделенных эритроцитах человека при добавлении криопротекторов, после замораживания до минус 19бС и оттаивания, в процессе хранения оттаянных эритроцитов, с одновременным определением объема, рН и концентрации ионов K!g2+.
В связи с указанной выше целью были поставлены следующие задачи:
1) исследовать скорость деградации 2,3-ДФГ в различны
условиях инкубации эритроцитов;
-
исследовать изменение рН в клетках в присутствии криопротекторов проникающего и непроникающенго типа и оценить степень влияния отдельных компонентов криозащитной среды на трансмембранный градиент рН эритроцитов человека;
-
исследовать динамику изменения объема клеток при экспозиции в криозащитных и других растворах;
-
исследовать динамику изменения уровня подвижных ионов Mg2+ в присутствии пропандиосахароля (ПДС) после замораживания-оттаивания;
Всю совокупность полученных результатов предполагалось использовать в построении модели влияния криоконсервирования на аппарат энергообеспечения эритроцитов.
Научная новизна.
В работе использованы новые методические подходы на основе ЯМР высокого разрешения, позволяющие изучають процессы метаболизма непосредственно в клетке, без ее разрушения.
Впервые непрерывно изучена динамика изменения основных фосфорсодержащих соединений (АТФ, 2,3-ДФГ) и Mg2+ крови, вне- и внутриклеточного рН, а также накопление неорганического фосфата в эритроцитах, непосредственно в процессе подготовки объектов к криоконсервации и деконсервации с различными криопротекторами. С помощью искусственного зонда исследована динамика изменения объема эритроцитов на фоне изменения концентрации 2,3-ДФГ в средах с проникающими и непроникавдими криопротекторами. Показано, что метаболизм макроэргических соединений существенно различен в интактных эритроцитах и в гемолизате. Установлен факт чувствительности сигналов 2,3-ДФГ к проникновению криопротектора внутрь эритроцитов. Для объяснения полученных экспериментальных результатов использовали модель, основанную на доннановской теории мембранного равновесия.
Наудш и Практическая ценность.
Проведенные в работе исследования позволяют выявить влияние ряда наиболее используемых криозащитных веществ проникающего и непроникающего типов на длительность лаг-фазы и на скорость распада 2,3-ДФГ в эритроцитах человека на стадиях подготовки к крио-консервированию и после замораживания-оттаивания. Полученные результаты представляют практическую ценность для разработки технологий криоконсервирования.
Ценным для практического применения может быть использование внутриклеточного зонда, как источника информации об изменении объема и кинетики гемолиза в процессе суспендирования эритроцитов в различных средах.
Проведенные исследования показывают, что 31Р-ЯМР в криобиологии дополняет известные методы и расширяет возможности экспериментатора в изучении внутриклеточных процессов в условиях криоконсервирования.
ІЕщр защищает. 1. Результаты исследования кинетики распада 2,3-ДФГ, АТФ и накопления неорганического фосфата эритроцитов в ходе подготовки к
криоконсервированию и после замораживания-оттаивания.
-
Результаты измерения рії в эритроцитах в процессе суспендирова-ния в средах с различными криопротекторами.
-
СпосоО использования искусственного зонда для оценки изменений объема эритроцитов в ходе подготовки их к криоконсервированию.
Апробация работы.
Материалы диссертационной раооты докладывались на 6-й Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров II-13 октября 1988 г. в г.Харькове, на 4-й Всесоюзной конференции по химии низких темепратур 21-23 декабря 1988 г. в г.Москве, на 8-й Всесоюзной конференции "Магнитный резонанс в биологии и медицине", 1990 г. в г.Черноголовка, на областной научно-практической нонф. 27-29 декабря 1989 г. в г.Харькове, на конференциях молодых ученых ИПКиК АН Украины 1988, 1989, 1990 гг. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ и получено одно авторское свидетельство на изобретение.
Объем и структура работы.
Похожие диссертации на Исследование метаболизма некоторых фосфатов эритроцитов в условиях криоконсервирования
