Введение к работе
Актуальность проблемы. Na,K-ATPa3a - это фермент плазматической мембраны клеток животных, который гидролизует АТР и использует освобождающуюся энергию для переноса ионов Na и К через мембрану против электрохимического градиента. В состав Na,K-ATPa3bi входит минимум 2 субъединицы: каталитическая а- и регуляторная гликозилированная Р-субъединица. Каждая из субъединиц представлена несколькими изоформами (al - a4 и pi - РЗ), кодируемыми различными генами. Изоформы могут сочетаться друг с другом в любых комбинациях, a 1-Субъединица встречается почти во всех тканях, но является основной в эпителии почек и солевых желез, а2 характерна для нервной ткани, сердца, адипоцитов, является основной в скелетных мышцах.
В результате функционирования №,К-АТРазы на плазматической мембране возникает потенциал покоя, а в возбудимых тканях может происходить генерация потенциала действия (Glitsch, H.G., 2001). Na,K-ATPa3a принимает участие в регуляции клеточного объема, транспорте некоторых ионов, глюкозы и аминокислот, сопряженных с переносом натрия. Кроме того, Na,K-ATPa3a является рецептором для сердечных гликозидов, которые, связываясь с ферментом, «включают» различные сигнальные каскады (Xie, Z., et al., 1999; Xie, Z., Askari, A., 2002).
Внутриклеточный трипептид глутатион (y-Glu-Cys-Gly) - это самый распространенный низкомолекулярный тиол в клетке. Глутатион существует в двух формах: восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG). Длительное время считалось, что функция глутатиона сводится к защите клетки от токсичных ксенобиотиков, поддержанию внутриклеточного редокс-статуса (Schafer, Е, Buettner, G, 2001) и антиоксидантному действию. В настоящее время появляется все больше данных о том, что связывание глутатиона с SH-группами цистеиновых остатков с образованием S-S-связи (S-глутатионилирование) может являться таким же важным механизмом регуляции функции белков, как и фосфорилирование (Mieyal, J., et al., 2008). Поскольку соотношение GSH/GSSQ определяющее редокс-статус клетки, изменяется при различных внутриклеточных процессах и существенно падает при развитии окислительного стресса, глутатионилирование является редокс-чувствительной модификацией, которая может
играть не только защитную, но и регуляторную роль (Schafer, F.Q., Buettner, G.R., 2001).
Установлено, например, что глутатионилированию подвергается Са-АТРаза саркоплазматического ретикулума, родственная Na,K-ATPa3e. В результате глутатионилирования Са-АТРаза активируется (Adachi, Т., et al., 2004). Показано также, что под действием GSH и ONOO" глутатионилированию подвергается Р-субъединица Na,K-ATPa3bi, что снижает активность фермента на 20% (Figtree, G, et al., 2009), однако глутатионилирование а-субъединицы этого фермента до настоящего времени не обнаружено.
Каталитическая а 1-субъединица Na,K-ATPa3bi содержит 23 остатка цистеина, 15 из которых располагаются в цитозоле клетки и могут быть доступны для окисленного глутатиона. Поочередная замена остатков цистеина на аланин сохраняет фермент в функционирующем состоянии, хотя в некоторых случаях наблюдается снижение числа оборотов фермента (Shi, Н. G, et al., 2000). В связи с этим возникает вопрос о роли SH-групп а-субъединицы Na,K-ATPa3bi и состоянии этих групп при изменении соотношения GSH/GSSQ особенно при повышении концентрации окисленного глутатиона.
Цель работы: исследовать глутатионилирование Na,K-ATPa3bi под действием окисленного глутатиона. Задачи:
-
Выяснить, происходит ли глутатионилирование каталитической а-субъединицы Na,K-ATPa3bi в клетке («базовое» глутатионилирование).
-
Установить, происходит ли глутатионилирование Na,K-ATPa3bi под действием окисленного глутатиона in vitro, и определить, влияет ли глутатионилирование на активность фермента.
3. Определить, какие изоформы а-субъединицы Na,K-ATPa3bi подвергаются
глутатионилированию.
4. Выяснить, какие SH-группы а-субъединицы подвергаются базовому
глутатионилированию, а какие глутатионилируются под действием GSSG in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые показано, что а 1-субъединица Na,K-ATPa3bi, выделенная из трех видов ткани (солевые железы птиц,
почки кролика и сердце крысы) содержит связанный глутатион («базовое» глутатионилирование). Впервые установлено, что в препарате Na,K-ATPa3bi, полученном из сердца крысы, глутатион связан и с а2-субъединицей. Показано, что глутатионилирование al-, но не а2-субъединицы, устраняется при выделении фермента в присутствии дитиотреитола.
Добавление окисленного глутатиона in vitro приводит к дополнительному глутатионилированию a 1-субъединицы, что сопровождается инактивацией фермента. Впервые проведен кинетический анализ инактивации №,К-АТРазы окисленным глутатионом и показано, что процесс ингибирования фермента двухфазный, определены константы скоростей для быстрой и медленной фазы ингибирования.
Впервые показано, что адениновые нуклеотиды (ATP, ADP и AMP) защищают Na,K-ATPa3y от инактивации окисленным глутатионом. Впервые установлено также, что глутатионилирование фермента под действием GSSQ приводящее к инактивации фермента, полностью предотвращает связывание ADP с №,К-АТРазой.
Впервые с использованием метода масс-спектрометрии проанализированы протеолитические фрагменты а 1-субъединицы Na,K-ATPa3bi и идентифицированы остатки цистеина, которые подвергаются базовому и дополнительному глутатионилированию. Установлено, что после обработки фермента смесью восстановленного/окисленного глутатиона в концентрациях, которые характерны для клетки в состоянии гипоксии (1,7 мМ/170 мкМ), увеличивается связывание глутатиона с 3 остатками цистеина (454, 458 и 459) а 1-субъединицы Na,K-ATPa3bi, расположенными в большой цитозольной петле, а также с остатком цистеина 244, расположенным в малой цитозольной петле. Из 15 цитозольных остатков цистеина а 1-субъединицы Na,K-ATPa3bi идентифицировано 13. Все они, за исключением остатка цистеина 423, способны взаимодействовать с глутатионом.
На основе опубликованных данных по трехмерной структуре а-1 субъединицы Na,K-ATPa3bi из почек свиньи совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН создана модель, позволяющая оценить площадь контактов аминокислот, участвующих в связывании АТР, и глутатиона, связанного с цитозольными остатками цистеина. В результате анализа наших экспериментальных
данных и данных, полученных на основе модели, впервые сделан вывод, что глутатионилирование остатков цистеина 454, 458 и 459 предотвращает доступ АТР к активному центру фермента, и наоборот, связывание АТР предотвращает глутатионилирование этих остатков.
Полученные результаты показывают, что при концентрациях окисленного глутатиона, которые существует in vivo при окислительном стрессе и гипоксии, происходит глутатионилирование SH-групп а-субъединицы Na,K-ATPa3bi, что предотвращает окисление этих SH-групп. При этом важные для ферментативной активности SH-группы Na,K-ATPa3bi защищены от глутатионилирования за счет связывания с активным центром адениновых нуклеотидов, в первую очередь, АТР. Глутатионилирование частично устраняется под действием дитиотреитола, и полностью под действием соответствующих ферментных систем (например, глутаредоксина в присутствии NADPH). Таким образом, глутатионилирование в состоянии гипоксии защищает существенные для активности SH-группы каталитической субъединицы Na,K-ATPa3bi от необратимого окисления, одновременно снижая активность фермента, потребляющего в норме значительное количество АТР. Полученные результаты могут оказаться полезными при разработке новых подходов к лечению ишемии, гипоксии, а также устранению последствий окислительного стресса.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2010), Международной конференции по Na,K-ATPa3e и родственным АТРазам (Асимолар, США, 2011), на 10-м Международном конгрессе "Регуляция клеточного объема" (Москва, 2013), а также на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2010, 2011, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликована 1 статья в издании, рекомендованном ВАК РФ, и 3 тезиса докладов на конференциях.
Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Цель и задачи исследования» «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа
изложена на страницах 108 машинописного текста, иллюстрирована 35 рисунками и 3
таблицами. Список цитированной литературы включает 224 печатных и Web-источников.
