Введение к работе
Актуальность проблемы. Способность быстро сопротивляться активно развивающейся микробной (в первую очередь, бактериальной) инвазии является жизненной необходимостью для любого многоклеточного организма. Вместе с эпителиальными барьерами эта способность вносит важный вклад в поддержание постоянства состава внутренней среды организма. Реакции многоклеточного организма, обеспечивающие врожденную невосприимчивость к микробным патогенам (система антимикробной защиты), разнообразны. Комплекс этих реакций могут составлять факторы как быстрого, так и медленного реагирования, присутствующие постоянно или появляющиеся индуцибельно, эффекторного или регуляторного действия. В зависимости от степени сложности такой системы она способна принимать на себя целый ряд дополнительных функций. Изучение имеющегося в природе разнообразия защитных антимикробных систем, построение морфо-функциональных рядов и понимание логики усложнения этих систем в связи с уровнем организации и систематическим положением организма представляет значительный теоретический интерес. Изучение защитной системы иглокожих позволяет провести сравнительный анализ таких систем между первично- и вторичноротыми беспозвоночными, а также между позвоночными и беспозвоночными вторичноротыми. Именно это определило выбор представителя иглокожих -Asterias rubens - в качестве объекта для изучения молекулярных основ противомикробной защиты. Целью нашей работы являлось: охарактеризовать антимикробный защитный потенциал целомической жидкости морской звезды Asterias rubens Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи.
-
Получение экстрактов из форменных элементов целомической жидкости морской звезды Asterias rubens, и выявление присутствия антимикробной активности в этих экстрактах и/или в плазме целомической жидкости.
-
Идентификация активных компонентов и выделение их в чистом виде.
-
Изучение физико-химических свойств выделенных пептидов, их секвенирование, сравнительный анализ и поиск структурно или функционально близких пептидов среди уже описанных молекул.
-
Синтез искусственных аналогов для более детального изучения их биоактивности.
-
Характеристика антимикробной активности выделенных молекул: широты спектра ингибирующего действия, а также механизма реализации этого действия.
-
Характеристика связи структурных особенностей пептида с механизмом его антибактериального действия.
Научная новизна. Впервые была предпринята попытка систематического изучения целомической жидкости морской звезды A. rubens на наличие антимикробных пептидов. Было выделено восемь новых пептидов с антимикробной активностью, и в частности, показано, что такой активностью обладают производные белков цитоскелета (актина и филамина). Впервые был клонирован фрагмент филаминового гена A. rubens, охарактеризованы размеры траскриптов генов филамина и
немышечного актина, показано увеличение уровня экспрессии филамияового гена в целомоцитах в
ответ на инъекцию ЛПС в полость тела.
Основные положения, выносимые на защиту. Антимикробная активность в целомической
жидкости связана с ее форменными элементами, но не плазмой. В целомоцитах присутствуют
несколько пептидов с антимикробной активностью, из которых было идентифицировано восемь и
показано, что пять из них представляют собой фрагменты цитоплазматических и ядерных белков. В
механизме проявления противобактериальной активности одного из них (ArFln-І) имеются две
составляющие: «базовый» механизм (действие на цитоплазматические мишени бактериальной
клетки), и «добавочный» (связан с нарушением барьерных свойств клеточной мембраны). Ключевым
фактором, влияющим на компетентность в реализации базового механизма, является катионность,
добавочного - гидрофобность.
Практическая значимость работы. Выделение новых антимикробных пептидов, а также изучение
одного из них (ArFln-І) с точки зрения взаимосвязи структуры и функции (включая бактерицидность,
специфичность и механизм действия) представляет значительный практический интерес для
разработки новых терапевтических препаратов - антибиотиков или же трансмембранных
переносчиков для других лекарственных агентов.
Апробация. Материалы диссертации были представлены на V и IX сессиях МБС СПбГУ (СПб 2003 и
2008); на Объединенных иммунологических форумах (Екатеринбург, 2004 и СПб 2008), в рамках
летней международной школы "Current trends in comparative immunology" (СПб, 2005), на 16-ом
Европейском иммунологическом конгрессе (16-th European Congress on Immunology, Paris, 2006) и на
V конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и
прогресс клинической медицины" (Москва, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 3 статьи в реферируемых
журналах, 8 тезисов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 машинописных страницах, состоит из
