Введение к работе
Актуальность проблемы. В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В октябре 2009 года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 516167 [Федеральный центр СПИД, 2009].
В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Одной из проблем в создании эффективной вакцины против ВИЧ-1 является его высокий уровень генетического разнообразия. Высокие частоты мутационных и рекомбинационных процессов, высокая скорость размножения и большой размер вирусной популяции ведут к высокой изменчивости вируса в каждом инфицированном организме [Но et al., 1995, Ни et al., 1990, Roberts et al., 1988]. Создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены [Напке et al., 2000]. ДНК-вакцина против ВИЧ, создающаяся исследовательской группой под руководством А.П. Козлова в Санкт-Петербурге, содержит ген белков оболочки ВИЧ-1 восточно-европейского варианта субтипа А, поскольку в момент разработки вакцины именно этот вариант доминировал в регионе [Мурашев и др., 2003]. Мониторинг генетического разнообразия ВИЧ-1 в популяции, а особенно в группах повышенного риска инфицирования ВИЧ, необходим для совершенствования профилактики, терапии и создания эффективной вакцины.
В момент инфицирования, за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма, происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции [Lawson et al., 2002]. В настоящее время существует теория о передаче половым путем (гетеро- и гомосексуально) преимущественно единичных геномов ВИЧ [Wolfs et al., 1992, Derdeyn et al., 2004, Long et al, 2000, Sagar et al, 2003]. Наличие подобной избирательности при парентеральной передаче ВИЧ-1 ранее установлено не было.
Детальная генетическая и иммунологическая характеристика переданных изолятов может помочь в разработке эффективной вакцины против ВИЧ. [Derdeyn et al, 2004, Gottlieb et al, 2008, Keele et al, 2008]. Разработан новый подход лабораторной оценки эффективности кандидатной вакцины -определение иммунологических свойств белков оболочки ВИЧ и особенностей их взаимодействия с нейтрализующими антителами на стандартизованных панелях псевдовирусов, полученных на основе переданных изолятов ВИЧ [Mascola et al, 2005]. Изучение разнообразия гена env передаваемых изолятов ВИЧ и создание панели псевдовирусов на их основе является одним из
наиболее перспективных подходов к созданию эффективной вакцины против BH4[Lietal,2005].
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучить разнообразие гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге, для последующего использования полученной информации в целях разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД. Задачи исследования:
Определить нуклеотидные последовательности фрагмента гена en v штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге.
Сравнить генетическое разнообразие ВИЧ-1 в различных группах риска.
Определить нуклеотидные последовательности полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в крови ПИН с острой и ранней стадиями ВИЧ-инфекции.
Оценить количество вариантов ВИЧ-1, передаваемых парентерально.
Изучить свойства гликопротеина оболочки gpl20 переданных штаммов ВИЧ-1.
Получить панель псевдовирусных конструкций, содержащих белки оболочки переданных изолятов ВИЧ-1 варианта А-ЕЕ для последующего изучения иммунологических свойств кандидатных вакцин против ВИЧ.
Научная новизна работы. Впервые показано особое положение штаммов субтипа В из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1. Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей рекомбинантной форме CRF06_cpx , в Санкт-Петербурге, и показана его вторичная рекомбинация с восточно-европейским вариантом субтипа А.
Впервые секвенированием единичных копий полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в организме ПИН, установлено наличие т.н. «бутылочного горлышка», т.е. избирательности при передаче штаммов ВИЧ парентеральным путем.
Впервые создана панель псевдовирусных конструкций на основе переданных штаммов восточно-европейского варианта субтипа А для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-1.
Научно-практическая значимость работы. Показано наличие двух независимых эпидемий ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге в группах риска ПИН и МСМ. Среди ПИН было выявлено присутствие преимущественно штаммов восточно-европейского варианта субтипа А (А-ЕЕ), тогда как среди МСМ циркулировали штаммы субтипа В. Показано, что новые случаи ВИЧ-инфекции вызываются штаммами А-ЕЕ, и таким образом установлена целесообразность испытания кандидатных вакцин против ВИЧ-1, содержащих гены варианта А-
ЕЕ среди ПИН. В рамках данной работы получены фрагменты и полноразмерные копии гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди групп риска в Санкт-Петербурге. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности, которые депонированы в международную базу данных GenBank. Выявлено наличие «бутылочного горлышка» при парентеральной передаче ВИЧ-1. Получена панель псевдовирусных конструкций на основе штаммов субтипа А, которая будет использована для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ.
Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в России и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.
Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнялась в рамках финансирования ННИУ «Биомедицинский центр» по федеральному проекту, выполняемому в соответствии с распоряжением Правительства РФ №1905-р «Разработка ДНК-вакцины против ВИЧ и молекулярно-эпидемиологический мониторинг разнообразия ВИЧ в Санкт-Петербурге», а также по грантам Международного центра Фогарти (Fogarty International Center) «Подготовка специалистов и исследования по превенции ВИЧ-инфекции в России» (№ 5D43TWO 1028) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследования в области ВИЧ и туберкулеза» (№RUBl-7000-ST-08).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16-й, 17-й и 18-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, Россия, в 2007, 2008 и 2009 годах; 14й, 15-й и 17-й конференциях по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, США, в 2007, 2008 и 2010 годах; 4-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Сидней, Австралия, 2007; Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, Россия, 2009. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 7 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована 23 рисунками, 10 таблицами и 2 приложениями. Список литературы содержит 314 литературных источников.
