Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитохромы Р450 относятся к внешним гемсодержащим монооксигеназам <ЕС 1.14.4.-) и образуют надсе-мейство из около 200 родственных генов со степенью гомологии кодируемых ими аминокислотных (а/к) последовательностей от 10 до 95%. Белки с гомологией первичных а/к последовательностей свыше 40% объединены в семейства, а свыше 46% - в подсемейства [1]. In vivo цитохромы Р450 являются наиболее мощными агентами, которые катализируют окислительный метаболизм самых разнообразных химических соединений эндо- и экзогенной природы, встречающихся в живых клетках. Этими цитохромами обладают все аэробные организмы. Только строго анаэробные прокариоты обходятся без Ферментов-Р450 2,3,4].
Наиболее изученными из цитехромов Р450 являются водорастворимый бактериальный Р450 101 (Р450сап) и мембрансвязанный микро-сомальный Р450 2В4. Для цитохрома Р450 101 имеются кристаллографические данные о пространственной структуре как собственно самого белка, так и его комплексов с субстратом, аналогами субстрата, а также с ингибиторами каталитической активности [5,6]. Прямых данных о пространственной структуре цитохрома Р450 2В4 нет, поэтому структурно-Функциональные соответствия для него были установлены косвенными путями.
Вследствие своей важной биологической роли и благодаря наличию большого числа гомологов надсемейство цитохромов Р450 является популярным объектом для изучения теоретических и прикладных аспектов структурно-функциональных зависимостей в белковых молекулах. Для выяснения этих зависимостей наряду с другими экспериментальными методами исследований может быть использован метод пептидного сканирования PEPSCAN [7,8], который является наиболее эффективным способом определения антигенных детерминант.
[1] Nebert et al.,, 1991, DHA and Cell Biology, 10, 1-14.
[2] Archakov and Bachnanova, 1990, Cytochrone P450 and Aotive
Oxygen, Suppl. Taylor & Francis, London-Hew York-Philadelphia.
[3] Guengerich, 1993, American Scientist, 81, 440-447.
[4] Koynans et al., 1993, Drug Hetabolisn Reviews, 25 (3), 325-
387.
[5] Poulos et al, 1987, J. Мої. Biol., 195, 687-700.
[6] Poulos, 1991, Heth. Enzyn., 203, 11-13.
[7] Geysen et al., 1984, Proc. Hatl. Acad.Sci. USA, 1984, 81,
3998-4002.
[8] Geysen et al., 1987, J. Івишіоі. Heth., 102, 259-274.
Антигенные детерминанты (эпитопы) нативного белка являются теми его участками, на которые вырабатываются и с которыми связываются во время иммунного ответа специфические антитеда. В большинстве случаев синтетические пептиды, идентичные линейным антигенными детерминантам, вызывают образование реагирующих с родительским белком антипептидных антител [9,10]. Такие пептиды могут быть использованы для получения антител, специфически реагирующих с соответствующими участками белков и, следовательно, могут служить основой для создания синтетических вакцин, новых диагностических систем, конструирования аналогов гормонов и модуляторов Фермент-субстратных взаимодействий, а также использоваться в структурно-функциональных исследованиях белковых молекул [11,12,131. Таким образом, получение информации об антигенных детерминантах нативного белка (антигенное картирование) является важной стадией для решения целого комплекса как теоретических, так и прикладных задач биомедицинских исследований.
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось полное антигенное картирование прокариотического цитохрома Р450 101 и эукариотического цитохрома Р450 2В4 методом пептидного сканирования PEPSCAN с последующим соотнесением полученных экспериментальных данных с известными структурно-функциональными областями исследуемых цитохромов, а также сравнением антигенных структур этих белков между собой. В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
-
Методом пиновой технологии синтезировать пептиды для антигенного картирования цитохромов Р450 101 и Р450 2В4.
-
Посредством ELISA-экспериментов определить способность синтезированных пептидов связываться с антисыворотками к цито-хромам Р450 101 и Р450 2В4 и по этим данным выявить линейные антигенные детерминанты исследуемых белков.
-
Выявить расположение антигенных детерминант относительно известных структурно-функциональных элементов исследуемых белков.
[9] Heloen et al., 1991, Ann. Biol. Clin., 49, 231-242.
[10] Pellequer et al., 1991, Heth. enzyn., 203, 176-201.
[11] Atas3i, 1984, Eor. J. Biochea., 145, 1-20.
[12] Arnon, 1986, Trends Biochen. Sci., 11, 521-524.
[13] Milich, 1989, Advances in Immunology, 1989, 45, 195-282.
4. Сравнить экспериментальные данные об антигенных детерминантах цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 с данными, полученными с использованием различных методов предсказаний.
Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что для цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 методом пептидного сканирования были определены линейные антигенные детерминанты. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в целях получения антипептидных антител, взаимодействующих с определенными участками цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 и, следовательно, могут служить основой для создания новых диагностических систем, модуляторов фермент-субстратных взаимодействий, а также использоваться в структурно-функциональных исследованиях цитохромов надсемейства Р450. Полученные данные могут быть использованы и для разработки новых методов предсказания антигенных детерминант белков, а также для компьютерного моделирования процесса укладки полипептидных цепей в пространстве.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8-ой Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Португалия, Лиссабон, 1993), на 10-ом Международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Канада, Торонто, 1994) и на международных конференциях "Chemical Diversity" и "Drug Design" (США, Сан-Диего, Калифорния, 1994). Апробация диссертации состоялась на научной конференции лабораторий НИН биомедицинской химии РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 12 рисунков, и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы".
