Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Солодарь Леонид Ильич

Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека
<
Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека
>

Данный автореферат диссертации должен поступить в библиотеки в ближайшее время
Уведомить о поступлении

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - 240 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Солодарь Леонид Ильич. Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.04 : Москва, 2003 117 c. РГБ ОД, 61:04-3/204-6

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 13

1.1 Надсемейство цитохромов Р450

1.1.1 Бактериальные (водорастворимые) Р450-содержащие системы 15

1.1.2 Микросомальные Р450-зависимые монооксигеназные системы 17

1.1.3 Митохондриальные Р450-зависимые монооксигеназные системы 21

1.1.4 Каталитический цикл микросомальных Р450 22

1.1.5 Основные типы реакций, катализируемые цитохромами Р450 25

1.1.6 Цитохромы Р450 человека и их значение 26

1.1.7 Цитохромы Р450 1А2 и 2В4 27

1.2 Экспрессия эукариотических цитохромов Р450 в Escherichia coli 28

1.2.1 Общие принципы создания экспрессионных систем Р450 29

1.2.2 Водорастворимые формы Р450 30

1.2.3 Оптимизация экспрессии 31

1.2.4 Очистка рекомбинантных цитохромов Р450 32

1.3 Пространственная структура Р450 36

1.3.1 Консервативные структурные последовательности Р450 38

1.3.2 Роль N-концевого региона и пролин-богатого участка эукариотических Р450 40

1.3.3 Гипервариабельные участки Р450 (модель Гото) 41

1.3.4 Роль заряженных аминокислотных остатков молекулы Р450 в межмолекулярных взаимодействиях с компонентами монооксигеназных систем эукариот 44

Заключение по обзору литературы 46

2. Материалы и методы 47

2.1 Материалы

2.1.1 Реактивы и приборы

2.1.2 Ферменты нуклеинового обмена 48

2.1.3 Бактериальные штаммы и ДНК

2.1.4 Среды и антибиотики 49

2.1.5 Олигонуклеотиды, использованные в работе 50

2.2 Методы 51

2.2.1 Компьютерное моделирование модифицированных форм CYP 1А2

2.2.2 Методики клонирования и микробиологические методы

2.2.3 Методики химии белков ->й

2.2.4 Аналитические и биофизические методы исследований "2

3. Результаты и обсуждение 68

3.1 Создание экспрессионных систем

3.1.1 Выбор участка для введения сайта протеолиза в молекулу CYP 1А2

3.1.2 «Кассеты экспрессии» 71

3.1.3 Оптимизирование условий культивирования штаммов Е. coli-продуцентов рекомбинантных цитохромов 72

3.1.4 Оптимизация условий экспрессии рекомбинантных Р450 2В4 в ферментере 82

3.1.5 Анализ экспрессии рекомбинантных цитохромов 2В4 и 1А2 методом иммуноблоттинга 83

3.2 Выделение и очистка вариантов рекомбинантных CYP450 2В4 и 1А2 85

3.2.1 Очистка GST/2B4(A2-27) и GST/2B4(A2-27)/His6 с помощью глутатион-Сефарозы 86

3.2.2 Очистка CYP450 с концевыми полигистидиновыми модификациями 89

3.2.3 Разностные спектры поглощения некоторых очищенных рекомбинантных цитохромов Р45 0 93

3.3 Ферментативные характеристики модифицированных форм CYP450 2В4 и 1А2 95

3.3.1 Энзиматические свойства вариантов CYP450 2В4 96

3.3.2 Энзиматические свойства CYP450 1А2 (HAS) 97

Заключение 98

Выводы 100

Благодарности 101

Список литературы 102

Микросомальные Р450-зависимые монооксигеназные системы

В растворе микросомальные цитохромы Р450 образуют агрегаты с молекулярным весом 300-600 кДа. Перенос электронов с редуктазы на цитохром Р450 происходит в результате образования в мембране диссоциирующих комплексов. При этом предполагается, что различные изоформы Р450 конкурируют за редуктазу, т. к. концентрация редуктазы в микросомах примерно в 10-40 раз ниже, чем цитохрома Р450 (Cawley G. F. et al., 1995).

Микросомальный Р450 (на примере 2В4) представляет собой интегральный мембранный белок (Archakov A. I. et al., 1975), который содержит приблизительно 60 % неполярных аминокислот, 80 % которых расположены на N-концевом и среднем участке полипептидной цепи (Hazzard J. Т. et al., 1991). Суммарный заряд молекулы цитохрома Р450 2В4 равен +6, а радиус молекулы составляет около 22 А. Первичная последовательность цитохрома Р450 2В4 включает в себя 491 аминокислотный остаток. N-концевой гидрофобный фрагмент содержит 26 аминокислотных остатков, из которых 86% являются гидрофобными.

Цитохром P450 в качестве простетической группы содержит гем. С помощью метода ЭПР показано, что гем ориентирован параллельно плоскости мембраны (Schwarz D. et al., 1990). Однако в литературе имеются данные, указывающие и на возможность расположения гема цитохрома Р450 перпендикулярно к плоскости мембраны (Edwards R. J. et al., 1991).

Аксиальные лиганды гема определяют спектральные и функциональные свойства фермента. Необычное положение максимума спектра поглощения СО-комплекса восстановленного гемопротеина обусловлено тем, что пятым лигандом железа гема является SH-группа цистеина (Champion Р. М. and Gunsalus I. С, 1977). Предполагается, что именно это обеспечивает легкость передачи электрона цитохромом Р450 различным акцепторам. Шестым лигандом в цитохроме Р450 является молекула воды (Di-Pruno С. et al., 1992; Poulos Т. L. et al., 1986; White R. E. & Coon M. J., 1982). Аксиальные лиганды гема определяют спиновое состояние цитохрома, окисленная форма которого находится в состоянии равновесия между высокоспиновой и низкоспиновой формами (Backes W. L. et al., 1980; Jansson 1. et al., 1987; Sato M. et al., 1977).

Эти формы цитохрома Р450 различаются количеством неспаренных электронов на внешнем энергетическом уровне атома железа гема и характеризуются различными спектрами поглощения. Для высокоспиновой формы цитохрома характерно наличие максимума поглощения при 392 нм, для низкоспиновой -при 416-417 нм. В низкоспиновой форме цитохром Р450 имеет 6 лигандов. Переходу гемопротеина в высокоспиновую форму предшествует диссоциация шестого лиганда (молекулы воды) (Di-Primo С. et al., 1992; Jansson I. et al., 1987). Спиновое состояние цитохрома P450 зависит от окружения гема. Субстраты и детергенты, также как и изменение рН среды и температуры, вызывают сдвиг спинового равновесия окисленной формы цитохрома Р450 (Gibson G. G. et al, 1986; Rutten A. A. et al., 1987). Высокоспиновая форма цитохрома P450 восстанавливается редуктазой быстрее, чем низкоспиновая (Backes W. L. et al., 1985). В присутствие NADPH-цитохром Р450 редуктазы спиновое равновесие гемопротеина смещается в сторону высокоспиновой формы, при этом гидрофильный фрагмент редуктазы отдельно не вызывает никаких спектральных изменений, а гидрофобный - вызывает переход цитохрома в низкоспиновое состояние (French J. S. et al., 1980).

Предполагается, что электростатические силы играют важную роль в формировании центра связывания субстрата молекулой цитохрома Р450 (Yanagita К. et al., 1997). Так, например, формирование активного центра цитохрома Р450 2В4 может осуществляться в результате взаимодействия отрицательно заряженной боковой цепи Glu250, расположенного на Cz-спирали, с положительно заряженной боковой цепью одной из аминокислот на I-спирали, предположительно His285 (Shulze J. et al., 1998).

Митохондриальные Р450-зависимые монооксигеназные системы объединяют в своей структуре свойства бактериальной и микросомальной систем: два её компонента - НАДФН-ферредоксиноксидоредуктаза (КФ 1.18.1.2) и ферредоксин - водорастворимы и локализованы в матриксе митохондрий, а третий - Р450, подобно микросомальным Р450, является мембранным белком внутренней мембраны митохондрий. Как и для бактериальных Р450, высокая степень субстратной специфичности митохондриальных Р450 млекопитающих является характерной особенностью этих белков.

Консервативные структурные последовательности Р450

На основании множественного выравнивания по алгоритму Гото (Gotoh О., 1999) всех первичных последовательностей цитохромов Р450, аннотированных в базе данных CPD (Lisitsa А. V. et al., 2001; http://cpd.ibmh.msk.su), был выявлен набор консервативных мотивов, определяющих консенсусы таксономических групп и всего надсемейства (Archakov A. I. et al., 2001). Эти мотивы можно соотнести с элементами вторичной структуры, а также с известными элементами по данным рентгеноструктурного анализа.

Известные на сегодняшний день высококонсервативные элементы вторичной структуры цитохромов отражены в табл. 3 вместе с аминокислотными мотивами, для которых известны функции (на примере CYP101 (Shimoji М. et al., 1998; Cosme J. & Johnson E. F., 2000)): N-концевые последовательности микросомальных Р450 имеют значительное отличие от известных секреторных сигнальных последовательностей (Haugen D. A. et al., 1977). Как правило, Р450 имеют большую продолжительность сигнальной последовательности и содержат неполярный сегмент (16 - 20 остатков), гидрофобность которого более выражена, чем у соответствующего сегмента белков с отделяемой сигнальной последовательностью. В этом отношении микросомальные Р450 имеют большее сходство с белками, содержащими мембранные «якорные» домены. У большинства микросомальных Р450 за гидрофобным участком, как правило, следует кластер основных аминокислотных остатков (High S. et al., 1992). Различные исследования были направлены на изучение влияния делеции N-концевых аминокислотных остатков на синтез in vivo, клеточную локализацию белка и каталитическую активность микросомальных Р450. В этих исследованиях цитохромы, лишенные гидрофобных N-концевых последовательностей, были гетерологически экспрессированы в эукариотических или бактериальных клетках. Существует, по крайней мере, два основных отличия между экспрессиями в бактериальной и эукариотической системах. Во-первых, бактерии лишены внутриклеточного эквивалента мембране эндоплазматического ретикулюма эукариот. Во-вторых, встраивание в бактериальную мембрану происходит посттрансляционно, в то время как у эукариот — котрансляционно (Wolin S. L., 1994). Этим может объясняться, почему делеция или модификация N-концевых аминокислотных остатков имеет различный эффект на свойства молекулы Р450, экспрессируемой в эукариотических или прокариотических клетках. Так Kusano К. et al. (2001) отмечают важность N-концевых аминокислотных остатков Р450, и особенно, полипролинового кластера, указывая на их участие в фолдинге молекулы и образовании гем-связывающего центра. Экспрессия ряда цитохромов с делециями полипролинового кластера приводила к резкому снижению выхода спектрально-активного белка по сравнению с нативными, при одинаковом уровне содержания фермента, обладающего общими с Р450 электрофоретическими и иммунологическими характеристиками. В последнее время ряд авторов сообщает о сигмоидальности кинетического графика Михаэлиса-Ментен фермент-субстратной реакции для некоторых микросомальных Р450 (Miller G. Р. & Guenderich F. Р., 2001; Kusano К. et al., 2001; Houston J. В. & Kenworthy К. E., 2000, 2001; Szklarz G. D. & Halpert J. R, 1998...), в частности, для 3A4, ответственного за 30-35% лекарственного метаболизма человека. В июне этого года Miller G. Р. & Guenderich F. Р. (2001) описана сигмоидальность кривой насыщения субстратом для 1А2 человека в реакции О-деметилирования 1-метокси-4-нитрофенола. Подобное явление может быть связано с наличием двух центров связывания в составе активного центра белка. Однако, методом молекулярного докинга Belkina N. et al. (1998) показали, что две производные резоруфина не могут одновременно размещаться в силу своих размеров внутри активного центра Р450. В этой связи приобретает особое значение гипотеза Davidov D. et al. (2000), согласно которой, при взаимодействии с редуктазой цитохромы образуют олигомеры (а в природе - гетероолигомеры). В результате варьирует доступность зон взаимодействия с белками-партнерами и субстратом. Мутации на границе пролин-богатого кластера могут приводить к изменению фолдинга и олигомерного взаимодействия, что может проявляться в виде негиперболических кинетических кривых насыщения. Р450 является локализация районов, ответственных за узнавание или связывание субстратов. В 1992-ом году Осами Гото (Gotoh О., 1992) на основании сравнительного анализа известных на тот период последовательностей: 51-го CYP2 (2А1-7; 2В1-5, 7, 9, 10,13 - по два представителя для 2В4 и 2В5; 2С1-9, 11-14, 16, 18, 19, 21, 22; 2D 1-6, 9, 10; три 2Е1 млекопитающих, 2F1, 2G1,2H1,2H2), 12-ти CYP1 (пять 1А1 млекопитающих; шесть 1А2 млекопитающих; 1А1 рыбы), 8-ми CYP3A(3Al-8), 8-ми бактериальных Р450 (101А, ЮЗА, 104А, 105А-С, 106А, 55А) и анализа известной на тот период пространственной структуры Р450101А (Р450сат), сумел выделить консенсусные SRS (substrate recognition sites, субстрат распознающие районы).

Оптимизирование условий культивирования штаммов Е. coli-продуцентов рекомбинантных цитохромов

Успешная продукция рекомбинантных цитохромов Р450 в различных системах экспрессии зависит от целого ряда параметров. Удачная комбинация вектора и клетки-хозяина, подбор условий культивирования, оптимизация структуры гена конкретного исследуемого цитохрома Р450 могут повысить выход функционально-активных ферментов в несколько раз. До недавнего времени принято было считать, что эффективная продукция CYP450 в системах, основанных на использовании промотора РНК-полимеразы фага Т7, недостижима, поскольку приводит лишь к избыточному накоплению рекомбинантных цитохромов в виде апо-белков либо в составе телец включения (Waterman М. R. & Johnson Е. F., 1991; Johnson Е. F. et al., 1996). Однако в последних работах показано, что "полноразмерные" микросомальные Р450 можно получать в бактериях под контролем Т7 промотора с довольно высоким выходом (Bridges A. et al., 1998; Saribas A. S. et al., 2001). С использованием процедуры, названной «эмпирической селекцией», нам удалось получить штаммы Е. coli с высоким уровнем продукции вариантов CYP2B4 с различными аффинными метками, «усеченных» с N-конца и полноразмерных. Этот же подход применяли и на ранних стадиях оптимизации экспрессии рекомбинантных цитохромов Р450 1А2 и 2В6.

Процедура состояла в следующем. Клетки Е. coli, несущие конструкцию, содержащую ген того или иного цитохрома, высевали на чашку Петри со средой М9, содержащей ампициллин в концентрации 200 мкг/мл. После 24 часов инкубации при 37С выросшие клоны пересевали на чашку Петри с LB-средой, содержащей 400 мкг/мл ампициллина, и продолжали инкубировать далее в течение 16 часов при 37С. После этого, клоны переносили в пробирки с жидкой средой LB, с концентрацией ампициллина 100 мкг/мл и их способность экспрессировать цитохром оценивали, как описано в разделе диссертации «Методы».

На сегодняшний день в литературе практически отсутствуют систематизированные данные по оптимизации условий культивирования штаммов-продуцентов цитохромов Р450. Сотрудники каждой конкретной лаборатории подходят к решению этого вопроса исключительно по-своему. В качестве «основного подхода» обычно применяют метод гетерологичной экспрессии нестабильных и токсичных для Е. coli чужеродных белков (Bujard Н. et al., 1987), включающий использование богатых культуральных сред, высокие концентрации селективных антибиотиков, постиндукционное культивирование при температуре ниже 30С в течение нескольких дней и добавление глюкозы до 2%. Далее практически все авторы при посеве клеток на колбы используют, так называемые, ночные «старт»-культуры, при (во время или сразу после) индукции добавляют предшественник синтеза гема — 5-аминолевулиновую кислоту (АЛА), и индуктор экспрессии - в зависимости от экспрессионной системы. На этом общие принципы культивирования штаммов-продуцентов Р450 себя исчерпывают.

На основании существующих на сегодня подходов к проблеме повышения продукции рекомбинантных гемопротеинов (Pernecky S. J. et al., 1995; Pompon D. et al., 1999; Guengerich P. F. et al., 1996; Bridges A. et al., 1998; Fisher Ch. W. et al., 1992; Barnes H. J., 1996; Peterson J. A. & Lu J.-Y., 1991; Sheller U. et al., 1996; Лепешева Г. И. и Усанов С. А., 1998; Saribas A. S. et al., 2001), для изучаемых нами систем были оптимизированы условия культивирования, а так же подобраны оптимальные концентрации различных биодобавок, увеличивающих продукцию цитохромов. Такими добавками являются: тиамин (Лепешева Г. И. и Усанов С. А., 1998), глюкоза (Hochuli Е., 1990) и, так называемый, «коктейль» солей микроэлементов (Guengerich P. F. et al., 1996). Также мы добавляли в среду индуктор экспрессии изопропил-P-D-тиогалактопиранозид (IPTG, ИПТГ), глицин, и АЛА. Как известно, реакция синтеза АЛА из глицина и сукцинила обратима. Поэтому при биосинтезе гема возможен переход части АЛА в сторону исходных веществ. Предположив это, мы стали добавлять глицин в культуральную среду, чтобы его избыток «сдвинул» химическое равновесие синтеза АЛА в сторону продукта. Глюкозу (до 2%) добавляют в культуральную среду, если экспрессируемый белок чужероден или токсичен для клеток-реципиентов, для того, чтобы замедлить экспрессию, «растянуть» ее во времени и дать клеткам возможность адаптироваться к «экстремальным» для них условиям. С этой же целью после индукции экспрессии клетки инкубируют при температуре, не превышающей 30С, а сам процесс экспрессии рекомбинантного фермента занимает довольно продолжительное время - до 2-3 суток, за время которых происходит также корректный фолдинг целевого белка.

Как показали эксперименты, температура среды после индукции экспрессии может варьировать в довольно широких интервалах. Так при показаниях термометра от 22С до 30С максимальный уровень содержания активного цитохрома мы наблюдали на вторые сутки после индукции; при температуре от 16С до 20С — на третьи сутки, и лишь при превышении 32-градусной отметки уровень экспрессии был неудовлетворительным. Таким образом, после индукции мы решили поддерживать температуру инкубационной среды в пределах 28-30С.

Следующий этап оптимизации продукции рекомбинантных Р450 заключался в анализе влияния отдельных условий или компонентов инкубационной среды на уровень экспрессии этих ферментов. В качестве «стартового» мы предпочли описанный выше, т. н., «основной подход» - то общее, что можно найти в любых литературных источниках, посвященных изучению рекомбинантных CYP450, например, в работе Pernecky S. J. et al. (1993). Выход спектрально-активных целевых белков в этих условиях изначально невысок (табл. 2), поэтому мы рассматриваем отдельно влияние некоторых факторов оптимизации (см. ниже).

На диаграмме 1 отражена временная зависимость синтеза активного Р450 2В4 (конструкция pZEl в BL21(DE3)) при температуре 30С. Уровень экспрессии рекомбинантных цитохромов определяли с помощью электрофореза и иммуноблоттинга с использованием специфических антисывороток, а также по спектрам поглощения карбоксикомплексов восстановленных гемопротеинов. Измерения содержания цитохрома Р450 в аликвотах суспензий клеток Е. coli проводили в расчете на единицу оптической плотности культуры.

Очистка CYP450 с концевыми полигистидиновыми модификациями

Для получения высокоочищенных препаратов цитохромов Р450 солюбилизированный материал клеточной мембранной фракции последовательно чистят на колонках с DEAE, Красной агарозой (Reactive Red-agarose), Bio-Beads, октилсефарозой и гидроксиапатитом (Miller G. P. & Guengerich F. P., 2001; Saribas A. S., Gruenke L. & Waskell L., 2001). Этот трудоемкий процесс требует как значительных затрат лабораторного времени и реактивов, так и изначально высокого уровня гетерологичной экспрессии. Созданные нами системы гетерологичной экспрессии Р450 с концевыми аффинными группами позволяют проводить эффективную очистку в одну стадию.

Очистку проводили путем нанесения мембранной фракции на соответствующий аффинный сорбент. Аффинные сорбенты, использованные для очистки различных рекомбинантных ферментов, приведены в табл. 10.

На этапах очистки с использованием хитиновой колонки нами была отмечена полная инактивация CYP2B4 при инкубации с 40 мМ ДТТ, необходимым для автопротеолиза гибридного белка. Попытки оптимизировать процесс очистки путем изменения концентраций ДТТ не имели успеха. Даже снижение концентрации ДТТ до 5 мМ, минимально необходимой для проведения хроматографии, не привело к ожидаемым результатам. Содержание спектрально-активного CYP450 за 3 часа инкубации с 5 мМ ДТТ понижалось более чем на 80% от исходного. В результате была показана принципиальная невозможность использования стандартного протокола очистки ("New England Biolabs", 1998) для цитохрома Р450 2В4 с использованием хитинового сорбента и автопротеолитических свойств белка интеина, присоединенного с С-конца.

Ранее Pernecky S. J. & Coon М. J. (1996) предложили способ получения очищенных препаратов цитохрома Р450 2В4(А2-27), основанный на протеолизе гибридного белка GST/2B4(A2-27) тромбином и аффинной очистке гемопротеина на колонке с GSH-агарозой. Метод позволяет получать препараты Р450 с удельной спектральной активностью (УА) около 6 нмоль/мг белка (УА гомогенного препарата фермента примерно 16-18 нмоль Р450/мг белка). В процессе выделения цитохрома Р450 по описанному методу нами был выявлен ряд существенных моментов (Соколов Н. Н. и соавт., 1999), которые были либо опущены, либо им не было придано серьезного внимания. Это касается, главным образом, стадии расщепления гибридного белка тромбином (условия протеолиза, терминация реакции, удаление примеси тромбина из очищенного препарата цитохрома). Кроме того, нами введены этап получения сферопластов с использованием лизоцима, УЗ-дезинтеграция клеток взамен их разрушения на Френч-прессе, добавление в буферные смеси ДТТ, ЭДТА и PMSF с целью стабилизации активности фермента при очистке и хранении (см. раздел 2.2.3), дана количественная характеристика способа очистки, не отраженная в работах вышеуказанных авторов.

С целью солюбилизации рекомбинантного цитохрома в мембранной фракции и для последующего использования в опытах по хроматографической очистке был проверен ряд детергентов (нонидет NP40, тритон N101, CHAPS, эмульгены 911 и 913, п-октил-В-Б-глюкопиранозид, твин-20 и тритон WR 1339). Наилучшие результаты в плане выхода рекомбинантного спектрально-активного белка получен при солюбилизации цитохрома с помощью CHAPS и эмульгена913.

При хранении около 2-х недель в рекомендуемых авторами условиях фракций частично очищенного препарата цитохрома Р450, полученных после расщепления гибридного белка тромбином, наблюдалось резкое снижение содержания гемопротеина, сопровождавшееся уменьшением размеров соответствующей этому белку зоны на электрофореграмме. Естественно было предположить, что это связанно с протеолитическим действием оставшегося в препарате тромбина. Для остановки реакции протеолиза нами был использован широко известный ингибитор сериновых протеаз PMSF, добавление которого в инкубационную пробу в конечной концентрации 1 мМ полностью подавляло протеолитическую активность тромбина.

Тромбин, вносимый в препарат CYP450 после первого этапа хроматографии на GSH-агарозе, представляет собой гетерогенную популяцию молекул, о чем свидетельствует электрофореграмма (рис. 25), где выявляются несколько белковых зон. Для удаления тромбина мы использовали колоночную хроматографию на гидроксиапатите (ГАП), широко применяемую при выделении и концентрировании очищенных препаратов цитохрома Р450, а так же для удаления примесей детергентов. Как видно из рис. 25, хроматография на ГАП позволяет удалить основную массу примесных белков тромбина. В то же время, попытка использования для этой цели хроматографии на колонке с бензамидин-Сефарозой 6В (сорбент специфически связывает протеазы) оказалась менее удачной. При элюции с этого сорбента не происходило достаточно полного освобождения препарата целевого белка от примесей тромбина, а так же наблюдалось значительное снижение выхода CYP450.

В табл. 11 приведены некоторые характеристики модифицированного нами метода получения очищенного препарата рекомбинантного цитохрома Р450. По УА (14,5 нмоль/мг белка) полученный препарат CYP450 имеет чистоту не менее 80% (рис. 25, трек 3). Выход гемопротеина на заключительном этапе очистки составил около 20%.

Похожие диссертации на Сравнительная характеристика вариантов систем экспрессии в клетках E. coli модифицированных форм цитохромов Р450 2В4 кролика и 1А2 человека