Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Активные формы кислорода 11
1.2. Роль параоксоназы 1 в развитии ИБС 16
1.2.1 Семейство параоксоназы 17
1.2.2 Структура и свойства белка-фермента параоксоназы 1 17
1.2.3 Субстраты параоксоназы 1 18
1.2.4 Содержание и активность параоксоназы 1 в организме 20
1.2.5 Варианты гена PON1 и их влияние на активность параоксоназы 1 21
1.2.6 Роль вариантов Q192R и L55M гена PON1 в развитии ишемической болезни сердца 23
1.2.7. Варианты в регуляторных областях гена PON1 24
1.3. Роль супероксиддисмутаза в развитии ИБС ' 25
1.3.1. Семейство супероксиддисмутазы 26
1.3.2 Супероксиддисмутаза 2 (СОД2) 29
1.3.3 Полиморфизм супероксиддисмутаза 2 (SOD2) 31
1.4 Роль каталазы в развитии ИБС 32
1.4.1 Полиморфизм гена каталазы (CAT) 33
1.5 Ишемическая болезнь сердца и свободнорадикальное окисление липидов 34
Экспериментальная Часть
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Объект исследования 42
2.2. Клиническая характеристика обследуемых групп: 43
2.3. Биохимические методы исследования 43
2.3.1. Определение окислительной модификации белков плазмы крови 43
2.3.2. Электрофоретические методы 45
2.3.3. Определение содержания малонового альдегида в сыворотке и эритроцитах крови 45
2.3.4. Определение активности параоксоназы сыворотки крови 46
2.3.5. Определение активности эритроцитарной каталазы 47
2.3.6. Определение активности супероксиддисмутазы 48
2.3.7. Определение липидных и липопротеиновых показателей сыворотки крови 48
2.4. Методы генетического исследования .- 49
2.4.1. Q192R полиморфизм гена параоксоназы 1 (PON1) 50
2.4.2. L55M полиморфизм гена параоксоназы 1 (PON1) 50
2.4.3. C-262T полиморфизм гена каталазы (CAT) 51
2.4.4. Ala 16 Val полиморфизм гена супероксиддисмутазы2 (SOD2) 52
2.5. Методы статистики, использованные в работе 52
2.5.1 Номинальные случайные переменные 53
2.5.2 Порядковые случайные величины 53
2.5.3 Непрерывные случайные величины 54
2.5.4 Относительные случайные переменные 54
Глава 3. Результаты экспериментов
3.1. Оценка проксидантной активности крови 56
3.1.1. Исследование состояния белков в крови больных при инфаркте миокардом 56
3.1.2. Перекисное окисление липидов 60
3.2. Активность антиоксидантной системы 61
3.2.1. Активность ферментов-антиоксидантов, уровень МДА и липидных показателей сыворотки крови 63
3.3. Молекулярно-генетическое тестирование и сравнительный анализ распределения аллелей генов PON1 (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) у мужчин и женщин, здоровых и больных ИБС 65
3.3.1. Анализ частот аллелей и генотипов Q192R renaPONl в исследуемых группах мужчин и женщин 65
3.3.2. Анализ встречаемости аллелей и генотипов CAT в исследуемых группах мужчин и женщин 69
3.3.3. Анализ частот аллелей и генотипов SOD2 в исследуемых группах мужчин и женщин 71
3.4. Анализ встречаемости сочетания аллелей 16Val гена SOD2, -262Т гена CAT,192R гена PON1 и 55М гена PON1 у пациентов исследованных групп мужчин и женщин 74
3.5. Изучение прооксидантных и антиоксидантных факторов и молекулярно-генетических маркеров генов PON1 (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, и в контрольной группе 76
3.5.1. Анализ активности ферментов антиоксидантной системы у больных ИМ до 45 лет и здоровых мужчин 75
3.5.2. Изучение уровня малонового альдегида в сыворотке крови в обследованных группах мужчин при различных генотипах PON1 (Q\92RnL55M), CAT(C-26TY)иSOD2(A\6V) 79
3.6. Анализ липидного спектра в группах мужчин и женщин, носителей разных аллелей гена PON1 Q192R и L55M 80
3.6.1. Анализа липидного спектра в группах мужчин и женщих, носителей ,разных аллелей гена САТ. 83
3.6.2 Анализ липидного спектра у носителей различных вариантов гена SOD2 88
Глава 4. Обсуждение результатов 93
Выводы 114
Список цитируемой литературы 117
- Активные формы кислорода
- Клиническая характеристика обследуемых групп:
- Оценка проксидантной активности крови
- Анализ частот аллелей и генотипов SOD2 в исследуемых группах мужчин и женщин
Введение к работе
Актуальность темы. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), такие как ишемическая болезнь сердца (ИБС), инфаркт миокарда (ИМ), ишемический инсульт и венозная тромбоэмболия, являются основной причиной смертности в странах Восточной Европы, в том числе и в России (Оганов Р.Г., 2004). Поэтому разработка программ ранней диагностики, профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний - одна из важнейших задач кардиологии.
Наряду с традиционными факторами риска в литературе широко обсуждается роль метаболических факторов риска в развитии ИБС. Так, одним из таких факторов является снижение антиоксидантной защиты у пациентов (Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999; Escola-Gil et al., 2006). Однако оценка активности основных ферментов-антиоксидантов у пациентов с ИБС в настоящее время недостаточно используется в клинической практике. По-видимому, это объясняется тем, что к настоящему времени практически не проводится исследований, посвященных комплексной оценке активности основных ферментов - антиоксидантов в сопоставлении со структурными особенностями кодирующих их генов, липидными и липопротеиновыми показателями крови и показателями окислительной модификации белков у больных ИБС различного возраста.
Поскольку процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) является инициирующим этапом атерогенеза, изучение активности таких ферментов-антиоксидантов как каталаза, параоксоназа 1 (PON 1), супероксиддисмутаза у больных ИБС разного пола и возраста является актуальной задачей. Выявление биохимических и молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с формированием низкой антиоксидантной активности крови необходимо для оптимизации лечения больных с ИБС и профилактики у них повторных ИМ.
Цель исследования: Выявить биохимические и молекулярно-генетические маркеры снижения антиоксидантнои защиты у больных ишемической болезнью сердца разного пола и возраста.
Задачи исследования:
1. Изучить окислительную модификацию белков крови и ПОЛ
сыворотки крови в группах обследованных мужчин.
2. Определить активность основных ферментов-антиоксидантов
каталазы, параоксоназы и супероксидисмутаз в крови у мужчин, перенесших
инфаркт миокарда, и в контрольной группе и сопоставить с уровнями
липидных показателей сыворотки крови и малонового диальдегида.
3. Выполнить молекулярно-генетическое тестирование и
проанализировать распределение аллелей и генотипов PON1 (Q192R и
L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) и их сочетаний в обследованных
группах с учетом пола и возраста.
4. Сопоставить показатели активности ферментов-антиоксидантов
каталазы, параоксоназы и митохондриальной супероксиддисмутазы с
результатами молекулярно-генетического тестирования генов PON1 (Q192R
и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V).
5. Сопоставить результаты молекулярно-генетического тестирования
генов PON1 (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) с уровнями
липидных показателей сыворотки крови у больных ИБС с учетом пола.
Научная новизна
Были изучены в сравнительном аспекте показатели белкового и липидного обменов и антиоксидантнои системы крови больных ИБС, перенесших ИМ, разного пола и возраста. В работе получены новые результаты, подтверждающие и дополняющие данные о взаимосвязи уровней липидных и липопротеиновых показателей сыворотки крови больных ИБС с показателями системы ПОЛ. В данной работе представлен анализ интенсивности окислительной деструкции белков в сыворотке больных,
перенесших ИМ как в молодом возрасте, так и в возрасте после 60 лет. Выявлена определенная взаимосвязь между уровнем окислительной модификации белков и активностью ферментов антиоксидантной системы крови. Впервые в работе изучены и проанализированы данные о частотах аллелей и распределении генотипов PON1 (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) и их сочетаний у больных ИБС - жителей Санкт-Петербурга, разного пола и возраста. Установлены достоверные различия в частотах аллелей 192R и Q192 гена PON1 у мужчин старше 60 лет, перенесших ИМ, по сравнению с их частотами у здоровых мужчин и женщин с ИБС. Впервые показано, что носители аллеля 16V гена SOD2 встречаются достоверно чаще среди мужчин, перенесших ИМ до 45 лет, чем среди здоровых мужчин. Впервые в работе изучена взаимосвязь аллелей и генотипов PON1 (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) с липидными и липопротеиновыми показателями сыворотки крови у больных ИБС разного пола и возраста. Впервые изучена связь активности ферментов-антиоксидантов у мужчин, больных ИБС, с носительством определенных аллелей и генотипов PON1 (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V).
Научно-практическая значимость работы
Результаты исследования расширяют и углубляют наши представления о молекулярно-генетической и метаболической основе сердечно-сосудистых заболеваний и необходимы для понимания роли генетических и биохимических факторов в развитии ИБС.
Полученные результаты характеризуются своей практической направленностью для медицины и являются полезными для выявления окислительного повреждения белков, которое, как правило, сопровождается необратимыми повреждениями тканей при ряде заболеваний, в том числе и ИБС. Использование биохимических и молекулярно-генетических методов для оценки состояния прооксидантной и антиоксидантной систем у больных с ИБС в практическом здравоохранении позволит оптимизировать
патогенетическую терапию с целью предотвращения развития повторных ИМ у пациентов. А у лиц, имеющих предрасположенность к развитию сердечно-сосудистых заболеваний, своевременное выявление низкой антиоксидантной активности крови позволит оптимизировать лечение и проводить первичную профилактику ИБС.
Внедрение результатов исследования
Полученные результаты использовались в лекционных курсах и лабораторном практикуме на кафедре биохимии для студентов Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии. Результаты исследования внедрены в практику подготовки и усовершенствования специалистов в области кардиологии на кафедре ФГЖ и ПП им. профессора И.М. Воронцова ФПК ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава. Результаты исследования используются в курсах подготовки врачей общей практики, а также в лаборатории молекулярной диагностики с расширенной группой экогенетики НИЦ ГОУ ВПО СПбГПМА Росздрава для усовершенствования специалистов в области медицинской и лабораторной генетики.
Личный вклад соискателя
Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Биохимические исследования, молекулярно-генетическое тестирование, анализ, интерпретация, изложение полученных данных, формулирование выводов и практических рекомендаций в основном выполнены автором лично.
Апробация работы
Материалы, использованные в диссертационной работе,
докладывались и представлялись на XIII Российском национальном
конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), межрегиональной
конференции «Актуальные проблемы фармации» (Рязань, 2006), на III съезде
фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению»
(Санкт-Петербург, 2007), научно-практической конференции «Фармация XXI века: достижения, проблемы и пути их решения» (Санкт-Петербург, 2008), XX International Congress of Genetics (Berlin 2008), European Human Genetics Conference (Barcelona, 2008).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Уровень окислительной модификации белков и показатели активности ферментов антиоксидантной системы крови, каталазы, параоксоназы и супероксиддисмутаз могут использоваться для оценки степени окислительного стресса у больных, перенесших ИМ как в молодом, так и в старшем возрасте.
Группы больных ИБС разного пола и возраста различаются по частотам аллелей и генотипов PON1 (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) и их сочетаний.
Выявлена ассоциация низкой активности параоксоназы с генотипом RR по гену PON1 (Q192R) у мужчин, перенесших ИМ до 45 лет.
Генотип ТТ по гену CAT (С-262Т) и сочетание аллелей 192R, 55М гена PON1, -262Т гена CAT и 16V гена SOD2 ассоциированы с изменениями липидного спектра крови у мужчин, перенесших ИМ до 45 лет, и женщин с ИБС.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2 статьи.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 148 машинописных страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований), обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы) (273 источника). Материал диссертации проиллюстрирован 15 рисунками, содержит 20 таблиц.
Активные формы кислорода
Биологическое окисление является одним из наиболее распространенных видов биохимических реакций, которые протекают в клетках и обеспечивают жизнедеятельность организма. В частности, в реакциях биологического окисления в качестве окисляемых субстратов выступают белки, липиды и углеводы, а в роли окислителя и акцепторов электронов - молекулярный кислород. Основными потребителями кислорода в организме являются митохондрии (от 85 до 96%), микросомального (от 5 до 15%) окисления (Осипов А.Н. и соавт., 1990). Кроме того, лейкоциты также имеют специализированные системы (НАДФН-оксидаза) для направленного образования всего спектра свободных радикалов кислорода (Владимиров Ю.А., 1998). Дополнительным источником АФК является генерация 02" ксантиноксидазой (Болдырев А.А., 1995).
Основное количество молекулярного кислорода (95-98%) в митохондриях расходуется на окислительный катаболизм субстрата и выработку энергии. И только относительно небольшая часть (2-5%) переходит в активные формы кислорода (АФК): радикал-анион супероксид . Пути генерации и способы защиты от АФК (по: Скулачев В.П., 1997) Основными мишенями, с которыми в клетках взаимодействуют АФК, являются биомолекулы, в повреждении которых и проявляется повреждающее действие кислородных радикалов. Поэтому при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их продуктов возникает состояние, так называемый окислительный (оксидативный) стресс, который и приводит к развитию различных патологических состояний. К настоящему времени наиболее изучено воздействие АФК на липиды. При атаке АФК липидов происходит свободнорадикальное окисление полиненасыщенных высших жирных кислот, так называемое перекисное окисление липидов (ПОЛ). Из высших жирных кислот, наиболее уязвимы для воздействия АФК те из них, которые имеют более длинные ненасыщенные углеводородные цепи (Осипов А.Н. и соавт., 1990). Таким образом, ПОЛ прежде всего повреждает клеточные биомембраны (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972); Продукты ПОЛ (малоновый альдегид, 4-гидроксиалкеналин и др.) являются мутагенами и, проявляют цитотоксичность (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Владимиров Ю:А. и соавт., 1991). Повышение содержания продуктов ПОЛ приводит к целому ряду патологий, таких как тромбоз, гипертонию, гиперчувствительность, участие в патогенезе бронхиальной астмы, шока, инфаркту миокарда и др. (Wallace S.S., 1997; ПескинА.В., 1997). Из АФК только ОН - радикал вызывает повреждение ДНК, такие как окисление оснований, их модификации, разрывы цепей (фрагментация самого биополимера.), повреждение хромосом. В результате окислительной деструкции ДНК образуются высокотоксичные производные альдегиды. Нарушение структуры ДНК во время атаки пуриновых и пиримидиновых оснований ведет, как известно, к появлению и закреплению мутаций. (Шинкоренко Н.В., 1986; Park J.W., Floyd R.A., 1992; Пескин А.В., 1997). Мутации могут привести к патологии и гибели , клеток, или их злокачественному перерождению (злокачественные образования, лейкозы и др;), а мутации в ДНК половых клеток - к наследственным заболеваниям. Высокое содержание АФК может ингибировать синтез ДНК и деление клеток и даже активировать апоптоз. Последнее может быть полезным для организма, так как ценойї гибели части клеток предупреждает прогрессирование злокачественных процессов и гибель организма, (de Zwart L.L., 1999; Хавинсон В.Х. и соавт., 2003). При повышении концентрации АФК в клетках наблюдается увеличение окислительной деструкции белков. Окислительной модификации белков могут подвергаться почти все аминокислотные остатки белков, что приводит к нарушению всех уровне структурной организации белковых молекул. Окислительное повреждение белков может сопровождаться окислением их сульфгидрильных групп и остатков триптофана, образованием битирозиновых сшивок и фрагментацией полипептидных цепей, главным образом, путем отрыва водорода у а-углеродного атома полипептидного остова молекулы белка и образованием карбонильных группировок. Интенсивность окислительной деструкции белков определяется главным образом особенностями их аминокислотного состава, а именно, количеством акцепторных групп аминокислотных остатков, которые способны перехватывать электроны от АФК, с образованием анион-радикалов (Шинкоренко Н.В., 1986; Янковский О.Ю., 2000).
Причиной возникновения меж- и внутримолекулярных сшивок главным образом является рекомбинация долгоживущих тирозил-радикалов, которые образуются при одноэлектронном окислении L-тирозина или при гидроксилировании фенилаланина, а также при окислении тирозина с участием миелопероксидазы (МПО) в присутствии перекиси водорода. При взаимодействии двух тирозил-радикалов образуется битирозин (Stadtman E.R., 1990). При окислительной модификации аминокислотных остатков в молекуле белка могут образовываться их альдегидные производные, взаимодействие которых с аминогруппами белков приводит к формированию ковалентных сшивок между полипептидными цепями за счет шиффовых оснований. При взаимодействии альдегидных производных аминокислот с SH-группами белковых молекул образуются полумеркаптаны (Янковский О.Ю., 2000).
В последнее время было показано, что при атаке АФК белков и аминокислот могут образовываться стабильные и долго живущие гидроперекиси. Наиболее уязвимыми оказались 6 аминокислот: глутамат, изолейцин, лейцин, лизин, пролин и валин, остальные аминокислоты практически не образуют гидроперекисей. Важным условием процессов перекисного окисления белков является способность кислорода проникать во внутреннюю область белковой глобулы, имеющей гидрофобный характер. Окислительная деструкция белков может происходить по механизму сайт-специфического повреждения белков. Это так называемое металлкатализируемое окисление белков, которое затрагивает только ту часть молекулы белка, которая участвует в связывании металлов переменной валентности, например, железо, медь. (Basaga H.S., 1990; Stadtman E.R., 1990а).
Изменение структуры окисленных молекул белков, как правило, сопровождается их агрегацией или фрагментацией, вплоть до их денатурации (Хавинсон В.Х. и соавт., 2003). В результате снижается или исчезает их многообразная функциональная активность (каталитическая регуляторная, транспортная, участие в матричном синтезе и др.). Некоторые из подвергшихся окислительной модификации белков способствуют мутациям или становятся аутоантигенами (Dean R.T. et al., 1997).
Для борьбы с АФК в настоящее время в медицине используются традиционные подходы противовоспалительной терапии с применением известных противовоспалительных препаратов, способных эффективно элиминировать АФК, например, гидроксил радикал и ОСГ. С целью предотвращения металлзависимых свободнорадикальных повреждений применяют препараты обладающие хелатными свойствами, в частности, хелаторы железа. Кроме того, для защиты от повреждений АФК используются препараты ингибирующие аппарат генерации кислородных радикалов у лейкоцитов.
Клиническая характеристика обследуемых групп:
Всего обследованы 597 человек - жители Санкт-Петербурга (437 мужчин и 159 женщин). Были сформированы следующие группы больных ИБС: 227 мужчин больных ИБС, перенесших ИМ в возрасте до 45 лет; 96 мужчин больных ИБС, перенесших ИМ в возрасте после 60 лет; 75 женщин в возрасте от 56 до 70 лет, наличие ИБС у которых доказано данными коронароангиографии. 114 здоровых мужчин в возрасте от 28 до 56 лет без признаков патологии сердечно-сосудистой системы составили первую группу сравнения. Вторую группу сравнения составили и 84 женщины в возрасте от 82 до 90 лет, не имеющих клинических и инструментальных данных, свидетельствующих о наличии ИБС. У этих пациенток не было ИМ, ишемического или геморрагического инсульта в анамнезе, сахарного диабета, тяжелой сопутствующей патологии. Они имели нормальное артериальное давление или мягкую/умеренную форму артериальной гипертензии. Третью группу сравнения составили 20 человек здоровых доноров, не имеющих ИБС в возрасте старше 60 лет (для изучения окислительной модификации белков в плазме крови).
Забор крови из локтевой вены у исследуемых осуществляли в утреннее время натощак. В качестве антикоагулянтов использовали раствор гепарина. Эритроциты отделяли от плазмы центрифугированием в течение 15 мин при 4000 g. Осадок отмывали 3 раза изотоническим раствором NaCl. Отмытые эритроциты крови гемолизировали 0,05 М раствором трис-HCl, рН=7,4, ("Sigma" USA) в соотношении 1:10.
Диагноз ИМ у всех больных был верифицирован на основании клинических и анамнестических данных, лабораторных показателей, данных эхокардиографии, коронарной ангиографии, закономерных изменений электрокардиограммы. Больные включались в исследование не ранее, чем через 0,5 года после развития ИМ. 2.3. Биохимические методы исследования 2.3.1.Определение окислительной модификации белков плазмы крови. Карбонильные группировки белков плазмы крови определяли по методу (Levine R. et al., 1990), с некоторыми модификациями (Дубинина Е.Е. и соавт., 1993; Smith CD. et al., 1991). Данные методы основаны на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофеннилгидразином (ДНФГ) с образованием окрашенных гидразонов, которые регистрируют спектрофометрически при- длинах волн 280 нм и 370 нм. При анализе спонтанной окислительной модификации белков плазмы крови- в опытные и контрольные пробы, содержащие 0,5-1,0 мг белка, предварительно обработанной плазмы, прибавляли по 0,5 мл 2 М НС1 (контроль) или 0,5 мл 10 мМ ДНФГ в 2 М НС1. Через 10 мин в контрольные и опытные пробы добавляли 1 мл 20% ТХУ После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре пробы центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут и осадки промывали дважды смесью этанола и этилацетата (1:1). При этом происходила экстракция ДНФГ и липидов, которые не прореагировали с карбонильными группами окисленных белков. Осадки подсушивали на воздухе, а затем растворяли в растворе 6 М мочевины, содержащем 20 мМ фосфата натрия (рН 2,3). Оптическую плотность полученных растворов 2,4-динитрофенилгидразонов регистрировали спектрофотометрически при X =370 нм. О содержании карбонильных групп судили по соотношению оптической плотности полученных растворов при 370 и 280 нм, а также выражали в нмоль образовавшихся гидразонов на 1 мг белка. Об интенсивности окислительной модификации белков судили также по степени окисления in. vitro и in vivo тирозиновых и триптофановых остатков. Одноэлектронное окисление тирозина генерирует долгоживущий тирозил-радикал, который при взаимодействии с таким же радикалом образует битирозин, стабильный в присутствии различных протеаз. Образующиеся битирозины обладают характерной голубой флюоресценцией. Окисление остатков триптофана в белке сопровождается снижением флуоресценции, характерной для триптофана. В настоящее время считают, что именно эти соединения могут быть адекватными маркерами окислительного повреждения белков in vitro и in vivo, так как в нативных белках они отсутствуют. (Ushisima Y. et al., 1984; Huggins T.G. et al., 1993; Арутюнян A.B. и соавт., 2000; Дубинина E.E. и соавт., 2002).
Для генерации АФК использовали среду Фентона: 0,65 10"4 М FeS04, 0,85 10"4 М ЭДТА (1:1) и 0,610-3 М Н202, фосфатный буфер 1/15 М (рН=7,4)-. Внесение в среду икубирования ЭДТА в качестве хелатирующего агента обеспечивающего сохранение в растворе окисленной формы железа (StadtmanE.R., 1990).
Контрольная проба содержала: 0,95 мл фосфатного буфера и 0,05 мл плазмы крови. Опытная проба содержала: 0,85 мл фосфатного буфера, 0,05 мл плазмы крови, 0,05 мл смеси FeS04 и ЭДТА (1:1) и 0,05 мл Н2О2. Обе пробы инкубировали при 37С в течении 1, 2-х и 24 часов. По истечении инкубации интенсивность окислительной модификации белков оценивали по степени образования битирозиновых сшивок и снижению флуоресценции триптофана.
Измерения проводили на спектрофлюориметре Hitachi в стандартной 90 геометрии. Степень окисления триптофана регистрировали при длине волны возбуждения 295 нм и длине волны испускания 340 нм. Образование битирозина регистрировали при длине волны возбуждения 325 нм и длине волны испускания 415 нм. Полученные результаты представлялись в виде процентов по отношению к контрольным пробам, в которых отсутствуют компоненты системы Фентон.
Оценка проксидантной активности крови
Сопоставление данных по содержанию общего белка в плазме крови показало, что при инфаркте миокарда у обследованных больных наблюдается достоверное снижение данного показателя по сравненению с контрольной группой (таблица 1). Однако и у обследованных больных этот показатель Таблица 1. Содержание белка в плазме крови, мг/мл (М+т) Мужчины в сыворотке крови не выходит за рамки референтного уровня основных биохимических показателей крови, для человека референтный уровень концентрации общего белка в сыворотке крови равен 65-86г/л. В последние годы внимание исследователей привлечено к изучению роли активных форм кислорода - (АФК) в процессах окислительной модификации белков. Так как, вызываемая ими окислительная модификация белков способствует усилению окислительного протеолиза в очаге воспаления (Дубинина Е.Е., Шугалей И.В., 1993; Лущак В.И., 2007). В нашей работе было установлено, что при инфаркте миокарда сопровождается окислительной модификацией белков. Об окислительной модификации белков судили по степени окислительного повреждения белков по уровню содержания карбонильных групп и увеличению степени окисления остатков тирозина и триптофана в молекулах белка. Данные представлены в таблицах 2, 3. Таблица 2. Как видно из представленных данных, у здоровых мужчин старше 60 лет уровень карбонильных групп в белках крови значительно выше, чем у здоровых мужчин до 45 лет. Полученные данные согласуются с результатами полученными другими авторами о возрастании окислительного повреждения белков при старении (Smith CD. et al., 1991; Sohal R.S., 1996; Лущак В.И., 2007). Показано, что у больных мужчин обеих исследованных групп происходит достоверное повышение реакционноспособных карбонильных групп в молекулах белков по критерию увеличения образования в реакционной среде окрашенных гидразонов по сравнению с контролем. В зависимости от интенсивности процессов образования АФК степень окислительной модификации аминокислотных остатков в молекулах белков могут быть различной (Янковский О.Ю., 2000). В частности, взаимодействие с белками гидроксильного радикала чаще вызывает их агрегацию. Ведущая роль в конъюгации белков принадлежит образованию битирозинов (битирозиновых сшивок). В реакциях Фентона, образующиеся гидроксильные радикалы вызывают образование стабильных битирозинов за счет межмолекулярных ковалентных сшивок между молекулами тирозина. (Davies K.J.A., 1987). В свою очередь окисление триптофановых остатков в молекулах белка отражает процессы фрагментации полипептидных цепей при действии АФК (Okajima Т. et al., 1990). Ранее были разработаны методики определения окислительной модификации белков по уровню образования битирозина и окисления триптофана и доказана возможность их применения для оценки интенсивности окислительного стресса у больных (Арутюнян А.В. и соавт., 2000; Морозова М.Г., 2000; Дубинина Е.Е., 2006).
Определение степени окисления триптофановых и тирозиновых остатков показало интенсивное образование битирозиновых остатков и увеличение степени окисления триптофана в белках плазмы крови обследованных больных в возрасте после 60 лет по сравнению с контрольной группой (таблицы 3).
Анализ возможных структурных изменений белков плазмы вследствии их окислительного повреждения проводили при помощи диск-электрофореза в ПААГ-DS-Na (Laemmli U.K., 1970). О наличии фрагментации полипептидных цепей судили по наличию на электрофореграммах белков с молекулярной массой от 14 до 20 кДа. Появление на электрофореграммах полипептидов с высокой молекулярной массой (выше 94 кДа) указывало наличие и усиление процессов агрегации белков. Данные представлены на рисунке 5. По данным электрофореза видно, что в сыворотке здоровых мужчин старше 60 лет наблюдается появление белковой зоны с молекулярной массой около 14 кДа, а также увеличение доли белков с молекулярными массами 14,4 кДа и 13 кДа по сравнению со здоровыми мужчинами до 45 лет. 2 3 45 67 8 9 10 11 0 Сравнительный анализ белкового спектра сыворотки крови здоровых мужчин различного возраста и обеих групп больных с инфарктом миокарда выявил значительное увеличение доли белков, рассчитанной по площади окрашенных зон, с молекулярными массами 20 кДа (от 6,0+0,2 мм2 в контроле до 9,0+1,0 мм2 в группах больных), 14,4 кДа (с 6,2+0,4 мм2 в контроле до 7,5+0,3 мм в группах больных). Кроме того, в сыворотке 70-80% больных мужчин выявлено появление новой белковой зоны (5,0+0,3 мм )с молекулярной массой около 17-17,5 кДа, которая не была идентифицирована на электрофореграммах у здоровых мужчин. 3.1.2. Перекисное окисление липидов Активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) является универсальной реакцией организма на патологическое воздействие. Активация ПОЛ, как правило, ведет к поражению мембран клеток и накоплению продуктов ПОЛ. Опыты по определению маркерного показателя окислительного повреждения липидов при окислительном стрессе -малонового диальдегида представлены в таблице 4. Как видно из представленных результатов, развитее инфаркта миокарда характеризуется выраженным дисбалансом системы ПОЛ и сопровождается резким накоплением конечного метаболита ПОЛ -малонового диальдегида. Так,уровень малонового диальдегида и в сыворотке крови и в эритроцитах крови больных обеих групп, перенесших инфаркт, был достоверно увеличен по сравнению с этим показателем в крови здоровых разного возраста, соответственно, в 2 и 2,5 раза. 3.2. Активность антиоксидантной системы Проявлению повреждающего действия свободных радикалов и перекисных соединений противостоит сложная многокомпонентная антиоксидантная система, которая обеспечивает связывание и модификацию кислородных радикалов, предупреждение образования или разрушения перекисей. Общая сумма биоантиокислителей создает в тканях "буферную антиоксидантную систему", которая обладает определенной емкостью, а соотношение прооксидантных и антиоксидантных систем определяет так называемый "антиоксидантный статус организма" (Соколовский В.В., 1998). Таким образом, степень окислительной деструкции белков в. организме зависит от состояния ферментативной антиоксидантной защитной системы. Поэтому в данной работе параллельно с оценкой уровня окислительной модификации белков изучали состояние каталазы, СОД и параоксоназы 1. Супероксиддисмутаза (СОД) - является ключевым ферментом антиоксидантной системы тканей, лимитирующим процессы превращения супероксидного радикала в другие активные формы кислорода, так как катализирует реакцию образования перекиси водорода и триплетного кислорода из суперокидного анион-радикала. Характерной функцией каталазы является высокоэффективный катализ диспропорционирования молекул перекиси водорода с образованием воды и молекулярного кислорода. В данном исследовании было установлено, что уровень активности каталазы эритроцитов был резко снижен в 6 раз, а активность СОД была достоверно снижена в 1,8 раза в крови больных мужчин по сравнению с здоровыми (таблица 5 ). Необходимо отметить, что примерно у 10% мужчин, перенесших инфаркт миокарда, были выявлены только следовые количества эритроцитарной каталазы.
Анализ частот аллелей и генотипов SOD2 в исследуемых группах мужчин и женщин
Анализ частот А16 и 16V аллелей SOD2 показал , что в группе мужчин, перенесших ИМ до 45 лет, частота аллеля 16А была достоверно ниже таковой в группе здоровых мужчин (х2=5,286, р=0,021) (рис. 14). Анализ распределения генотпов гена SOD2 показал (рис. 14), что в группе мужчин, перенесших ИМ до 45 лет носители вариантов V/V+A/V встречались достоверно чаще, чем в группе здоровых мужчин (х2=6,192, р=0,013). У женщин таких различий выявлено не было. Таким образом, в обследованных группах пациентов частоты аллелей PONl (Q192R и L55M), CAT (С-262Т) и SOD2 (A16V) не отличались от теоретически ожидаемых в соответствии с законом Харди-Вайнберга, что говорит о репрезентативности выборок. Анализ распределения аллелей и генотипов С-262Т гена CAT в исследованных группах пациентов не выявил достоверных различий. Анализ частот аллелей и генотипов Q192R и L55M PON1 и A16V SOD2 выявил некоторые различия.В группе женщин с ИБС аллель Q192 и генотип QQ по гену PON1 выявлялись достоверно чаще, чем в группе мужчин, перенесших ИМ после 60 лет. В то же время, у мужчин, перенесших ИМ после 60 лет, носители аллеля 192R встречались достоверно чаще, чем в группе здоровых мужчин. Среди женщин с ИБС носители аллеля 55М и генотипа ММ по гену PON1 встречались чаще, чем в группе женщин старше 80 лет, не страдающих ИБС. Кроме того, в группе женщин с ИБС носители генотипа ММ гена PON1 встречались в 2 раза чаще, чем в группе мужчин с ранним ИМ (ОР=2,13 для 95% ДИ 1,14-3,98 ).
В группе мужчин, перенесших ИМ до 45 лет, носители аллеля VI6 гена SOD2 встречались достоверно чаще, чем в группе здоровых мужчин. Генетические различия между мужчинами и женщинами могут иметь существенное значение в проведении дальнейших исследований факторов риска ИБС. 3.4. Анализ встречаемости сочетания аллелей 16Val гена SOD2, -262Т гена CAT, 192R гена PON1 и 55М гена PON1 у пациентов исследованных групп мужчин и женщин При проведении данного анализа в качестве редких были приняты реже встречающиеся варианты исследованных генов, конкретно следующие: 16Val SOD2, -262Т CAT, 192R PON1, 55М PON1. Для анализа использвались такие сочетания: - Группа "4", пациенты у которых были выявлены сразу четыре редких аллеля: \6ValSOD2+ -262Т САТ+ 192RPON1+55MPON1. В группе мужчин, перенесших ИМ до 45 лет, лица с сочетанием всех четырех аллелей 16V SOD2, -262Т CAT, 192R и 55М PON1, находящихся как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии, встречались достоверно чаще, а лица с сочетанием любых двух из перечисленных вариантов -достоверно реже, по сравнению с таковым в группе здоровых мужчин (ОР=2,5 для 95% ДИ 1,1-5,8; ОР=0,7 для 95% ДИ 0,5-0,9; соответственно). В то же время, анализ распределения генотипов в зависимости от количества данных генетических вариантов в группах женщин не выявил значимых различий (х2=3,095; р=0,511).
В тоже время среди женщин, страдающих ИБС, носители комплекса аллелей 16Val SOD2, -262Т CAT, 192R PONI, 55М PON1 встречались значимо реже по сравнению с таковыми в группе мужчин, перенесших ИМ до 45 лет (р=0, 011). Данные встречаемости редких аллелей в изученных группах редставлены в таблице 11 и рисунке 15. 3.5. Изучение прооксидантных и антиоксидантных факторов и молекулярно-генетических маркеров генов PON1 (Q192R и L55M), С4Г(С-262Т) и SOD2 (A16V) у пациентов, перенесших инфаркт миокарда, и в контрольной группе 3.5.1. Анализ активности ферментов антиоксидантнои системы у больных с ИМ до 45 лет и здоровых мужчин Сравнительный анализ активности параоксоназы 1 при различных генотипах Q192R гена PON1 в группе больных мужчин, перенсших ИМ до 45, выявил статистически значимые различия в активности параоксоназы 1 у пациентов, имеющих генотипы QQ и RR (ANOVA, р=0,012). Активность параоксоназы 1 у носителей генотипа RR была достоверно ниже, чем у носителей генотипа QQ Таблица 12. Активность параоксоназы у носителей генотипа PONI Q192R У гетерозигот были промежуточные значения активности параоксоназы 1, которые не отличались значимо от значений активности параоксоназы 1 как у гомозигот QQ, так и у гомозигот RR (соответственно, ANOVA, р=0,062 и р=0,507). Данные представлены в таблице 12.
Не было обнаружено статистически значимых различий в активности параоксоназы 1 у здоровых мужчин при различных генотипах , хотя мужчин, имеющие генотип RR имели более низкие значения активности PON1 по сравнению с носителями генотипов QR и QQ. Анализ активности параоксоназы при различных генотипах L55M гена PON1 не выявидл достоверных различий в обследованных группах мужчин (ANOVA, р=0,817; ANOVA, р=0,841). Данные представлены в таблице 13. Анализ активности каталазы показал отсутствие значимых различий данного показателя при различных генотипах CAT, как в группе здоровых мужчин (ANOVA, р=0,597), так и больных , перенесших ИМ в молодом возрасте (ANOVA, р=0,655). Активность каталазы эритроцитов крови достоверно не различалась у обследованных мужчин, имеющих различные генотипы CAT. Данные представлены в таблице 14.
