Введение к работе
Актуальность проблемы. На сегодняшний день в Российской Федерации остаются достаточно большие запасы химического оружия, в том числе зомана и RVX, относящихся к группе фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ). Согласно Конвенции по Химическому Разоружению [Анон, 2005а] в РФ проводятся мероприятия по их обезвреживанию на объектах уничтожения химического оружия (УХО). Обезвреживание ФОВ осуществляется с помощью различных дегазирующих растворов, при этом необходимо вести непрерывный мониторинг остаточных количеств ФОВ на поверхностях технологического оборудования, в производственных сточных водах и объектах окружающей среды.
В РФ в качестве скршшнговых методов определения остаточных количеств ФОВ аттестованы и повсеместно применяются метод Эллмана и метод с бромтимоловым синим [Анон, 2004а, 20046, 2004в, 20056, 2005в, 2006а]. Однако компоненты дегазирующих растворов, продукты гидролиза ФОВ и другие примеси часто мешают определению ФОВ указанными методами, что приводит к получению ложноположительных и, что особенно опасно, ложноотрицательных результатов, которые можно выявить только с помощью более специфического и дорогого химического анализа. Однако он характеризуется гораздо более высоким пределом обнаружения по сравнению с биохимическим анализом, поэтому нет возможности проверять с его помощью все получаемые результаты. Для повышения специфичности более дешевого и простого в исполнении биохимического анализа необходимо установить точные границы применения уже существующих биохимических методов, т.е. исследовать их устойчивость к влиянию посторонних примесей, затем по возможности расширить их границы или подобрать альтернативные методы, обладающие большей специфичностью и не уступающие в чувствительности аттестованным биохимическим методам. Кроме низкой специфичности, к недостаткам аттестованных методов определения ФОВ можно отнести низкую производительность, большой объем проб и расход реагентов, необходимых
для проведения анализа. Кроме того, данные методы не позволяют оцепить опасность многокомпонентной пробы для человека.
Помимо оценки антихолинэстеразной активности проб с объектов УХО, необходимо проводить оценку их токсичности, а затем опасности для человека. Традиционно это выполняют в экспериментах на гидробионтах [Саноцкий и др., 1986; Анон, 1998, 20076; Кокуричева и др., 2005], реже на теплокровных животных [Анон, 1980а, 19806, 2003]. Принципиально новым подходом в этой области могло бы стать использование в качестве тест-объектов клеточных культур, особенно человеческих клеточных линий [Tiffany-Castiglioni et al., 1999, Tiffany-Castiglioni et al., 2006]. Человеческая линия нейробластомы SH-SY5Y представляется нам уникальным объектом, позволяющим проводить определение цитотоксичпости проб с объектов УХО параллельно с определением количества ФОВ в этих пробах модифицированным вариантом метода Эллмана, поскольку в плазматической мембране этих клеток экспрессировано большое количество АХЭ [Ehrich et al., 1995]. Большинство ложных результатов, получаемых биохимическими методами, связано с непосредственным контактом компонентов исследуемой пробы с реагентами этих методов. Поскольку клетки нейробластомы являются адгезионными, добавление в анализ дополнительной процедуры отмывки клеток от исследуемых проб поможет значительно сократить количество ложных результатов.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в поиске наиболее перспективных с точки зрения оценки остаточных количеств ФОВ биохимических методов определения активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), переводе этих методов на планшетный формат и установлении границ применения данных методов.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи: 1. Перевод методов Эллмана и Хестрина на планшетный формат,
определение границ линейных диапазонов и пределов обнаружения
методов для двух ФОВ: зомана и RVX.
Изучение причин возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов биохимического анализа.
Моделирование ложноположительных и ложноотрицательных результатов с использованием известных веществ и с учетом особенностей состава проб с объектов УХО.
Поиск способов устранения ложных результатов биохимического анализа.
Перевод метода Эллмана на планшетный формат с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y и его апробация на двух ФОВ: зомане и RVX.
Научная новизна. Для определения содержания ФОВ в пробах сложного состава впервые применен метод Хестрина. Разработанный планшетный вариант данного метода значительно превосходит аналогичный вариант метода Эллмана по специфичности и селективности проводимого анализа, не уступая ему по чувствительности и диапазону линейности. Впервые предложено использование клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y как для оценки содержания ФОВ в пробах сложного состава, так и для определения их цитотоксичности.
Практическое значение работы. Разработка и аттестация новых методик выполнения измерений (МВИ) на основании полученных данных позволит сократить количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, получаемых биохимическими методами при анализе проб сложного состава, в частности проб с объектов УХО. Перевод существующих биохимических методов на планшетный формат повысит их производительность, а также снизит стоимость анализа. Кроме того, существенно уменьшится объем исследуемой пробы, который иногда является лимитирующим фактором при проведении анализа. Использование клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y для анализа многокомпонентных проб позволяет оценивать не только содержание в них ФОВ планшетным вариантом
метода Эллмана, но также их цитотоксичность. С помощью данной тест-системы возможно проведение исследований механизмов действия ФОВ, которые к настоящему моменту детально не изучены.
Публикации и апробация работы. Основные материалы опубликованы в 15 печатных работах, из них 9 статей в реферируемых журналах, 3 статьи в сборниках, 3 тезисов докладов. Результаты исследований доложены на 12-й Международной конференции по химическому разоружению (CWD 2009, Стратфорд-на-Эйвоне), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2009), 61-й Международной конференции и специализированной выставке аналитической химии, технологий, прикладной спектроскопии и смежных отраслей (PITTCON 2010, Орландо), 49-й Ежегодной токсикологической конференции и специализированной выставке (SOT 2010, Солт Лейк Сити), Съезде Аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва, 2010).
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 25 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания экспериментальной части и ее обсуждения, заключения, списка цитируемой литературы, который включает в себя 23 отечественных и 76 зарубежных источников.
