Введение к работе
Актуальность исслед,ования. Одной из наиболее актуальных проблем в области современной нейрофармакологии является проблема изыскания эффективных фармакологических средств для оптимизации интеллектуально-мнестической деятельности мозга, коррекции нарушений памяти, лечения больных с длительно текущими органическими и функциональными заболеваниями. Прогресс в этой области невозможен без глубокого понимания физиологических и молекулярных механизмов действия применяемых препаратов. Однако, несмотря на очевидные успехи в выяснении механизмов памяти, в настоящее время не сложилось единого мнения, какие биохимические события определяют процесс закрепления информации в долговременной памяти. По-прежнему остается открытым вопрос о путях оптимизирующего влияния нейроактивных веществ на высшие интегративные функции мозга. Использование большинства из них является эмпирическим и лишь отчасти основано на понимании нейрохимических событий, лежащих в основе образования, хранения и реализации временных связей - в основном тех, которые так или иначе связаны с изучением взаимодействия нейромедиаторов с рецепторами клетки-мишени.
Общепризнанно, что необходимым этапом в механизмах закрепления информации является активация экспрессии генома (Ашмарин, 1989; Круг ликов, 1985, Kandel, 1990; Malthies, 1989). При этом подразумевается, что эта активация является "синап тической" и осуществляется через систему вторичных посредников. Однако, конкретные механизмы функциональной регуляции транскрипционной активности в нейронах не ясны, а, следовательно, остается открытым вопрос о путях вовлечения синтеза РНК и белка при действии нейроактивных веществ в процесс консолидации следа памяти. В посіедние годы получены данные о непосредственном взаимодействии нейромедиаторов и гормонов со структурами клеточных ядер (Розен, 1985,1991; Третьяк, 1990; Evans, 1988; Vedeckis, 1992). Однако, эти отрывочные сведения не дают ясного представления о механизмах их взаимодействия с генетическим аппаратом, о' роли ядерных молекулярных мишеней нейроактивных соединений в регуляции транскрипции и, тем более, о значении данного феномена для функционирования нейронов. Вместе с тем, решение этого вопроса является весьма перспективным, так как может не только внести существенный вклад в понимание биохимических событий, обеспечивающих процесс фиксации и хранения следа памяти, но и создать реальную основу для изыскания принципиально новых эффективных ноо гропных среде гв.
Изучение молекулярных механизмов памяти является плодотворным лишь при наличии адекватных модельных систем. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы может быть применение в качестве фармакологических
зондов мнемотропных соединений с четхо определенным спектром физиологических эффектов. Очевидно, что механизм действия используемых препаратов должен Сыть расшифрован полностью.
С этой целью в настоящей работе были использованы производные имидазолдикарбоновой кислоты (антифеины), синтезированные в отделе нейрофармакологии НИИЗМ РАМН (С.В.Аничков и соавт., 1958). Они отличаются по своему химическому строению лишь радикалом в первом положении имидазольного кольца, близки по целому ряду физиологических и метаболических эффектов, но обнаружили разнонаправленное действие на сохранение выработанного навыка. Наиболее изученный представитель этой группы этилнорантифеин (этимизол) отнесен к препаратам с элементами ноотропного типа действия и с успехом применяется в неврологической практике. Однако, несмотря на высокую эффективность этилнорантифеина при ряде патологических состояг*ій, до настоящего времени остаются неизученными те тонкие биохимические механизмы, которые определяют высокую нейротропную активность этого препарата. Максимальная избирательность действия именно на процесс сохранения информации, высокая эффективность этимизола при однократном использовании позволяли предполагать его действие на функционально значимые метаболические звенья, лежащие в основе этого процесса.
Таким образом, перспективность исследования путей функциональной регуляции РНК-синтезирующей системы клеток головного мозга и необходимость поиска адекватных подходов для такого изучения определили цель настоящей работы - исследование молекулярных механизмов реализации мнестических эффектов антифеинов. Для решения этой проблемы представлялось целесообразным поставить следующие задачи:
-
Провести сравнительный анализ влияния антифеинов (этил-, аллил-, пропилнорантифеин, деметилированные производные аллил- и этилнорантифеина - М« и Мр) на процесс выработки и сохранения условных рефлексов с их действием на синтез макромолекул.
-
Исследовать влияние соединений из группы антифеина на ключевые компоненты системы рецептор - вторичный посредник.
-
Исследовать систему ядерных молекулярных мишеней антифеинов; изучить роль прямой активации транскрипционной активности клеток головного мозга в долговременном сохранении следа памяти.
Научная новизна. В работе впервые экспериментально обоснована эффективность фармакологического подхода для изучения молекулярных механизмов памяти.
Впервые проведено комплексное исследование г руппы веществ с близкой структурой и разнонаправленными мнестическими эффектами на поведенческом,
з клеточном и молекулярном уровнях. При однократном введении этилнорантифеин и его деметилированные производные М,. М,, аллил-, пропилнорантифеич оказывают нейроспецифическое разнонаправленное действие на РНК-синтезирующую систему гиппокампа и нейронов коры головного мозга крыс, что коррелирует с противоположным влиянием этих соединений на сохранение условных рефлексов. При этом введение веществ с положительным влиянием на транскрипционную активность приводит к увеличению синтеза белков синаптических мембран, уровня их фосфорилирования и активности мембранносвязанной протеинкиназы С.
Впервые на молекулярной модели функционирования аденозиновых рецепторов изучено влияние антифеинов на аданилатциклазу. Установлено, что действие этимизола и его структурных аналогов не опосредовано А1 и Ag рецепторами аденозина. Активность высокоаффинной ФДЭ сАМР синаптических мембран изменяется однонаправленно при действии антифеинов. Впервые показано, что вещества с эффективным положительным влиянием на транскрипционную активность могут не оказывать прямого действия на структурно-функциональное состояние мембран (диеновые и триеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, Na.K-АТРаза, Мд.Са- и Са-АТРазы,-протеинкиназа С). Ключевую роль в действии антифеинов на сохранение следа
памяти играет изменение РНК-синтезирующей системы нейронов.
14 Впервые обнаружено, что С-этимизол после однократного" применения
способен проникать в ядра клеток головного мозга и специфически связываться с
компонентами хроматина.
Установлена способность веществ с эффективным влиянием на процесс сохранения следа памяти (антифеины, пирацетам, кофеин) изменять транскрипционную активность нейронов при их непосредственном взаимодействии с хроматином. Показано, что только этилнорантифеин и его деметилированные производные повышают Са-АТРазную активность хроматина гиппокампа и нейронов коры головного мозга.
Впервые для выяснения функциональной роли сАМР-независимого фосфорилирования негистоновых белков использован комплексный подход: анализ фосфорилированных белков хроматина клеток головного мозга в системных опытах и in vitro: применение антисывороток к белкам HMG 2, HMG 14, HMG 17; выделение, очистка, идентификация сАМР-незгвисимых протеинкиназ I и II казеинового типа из хроматина нейронов и глии, а также отдельных фракций HMG белков. Впервые показано, что действие антифеинов зависит от типа фермента и природы белка-субстрата. Установлено, что регуляция транскрипции ангифеинами при изменении функционального состояния головного мозга происходит при участии фосфорилированной формы белка HMG 14. Показано, что этилнорантифеин и его аналоги не влияют на транскрипционную активность
хроматина г лий и его сАМР-независимое фосфорилирование. Обнаружено
разнонаправленное влияние антифеиноз на автофосфорилирование
протеинкиназы ЬШ. Впервые установлено, что при действии веществ с
определенной структурой может происходить дополнительное
фосфорилирование, наряду с р-регуляторной, а-каталитической субъединицы фермента, чю коррелирует с их стимулирующим влиянием на фосфорилирование HMG 14 и транскрипцию. Установлено, что молекулярной мишенью действия антифеинов на хромаїин является комплекс сАМР-независимая лротеинкиназа N11 - негистоновый белок HMG14. Непосредственное влияние антифеинов на сАМР-независимую протеинкиназу Nil может играть пусковую роль в их эффективном разнонаправленном действии на транскрипционную активность и сохранение следа памяти.
Научно-практическое значение работы. Работа, в основном, носит теоретический характер. Выдвинуто новое направление в биохимической фармакологии изучение молекулярных механизмов памяти с помощью фармакологических зондов - соединений с близкой структурой и избирательным дейс гвием на отдельные этапы памя ти.
Полученные в работе данные о непосредственном воздействии эффективных мнемотропов на системы регуляции функциональной активности генома нервных клеток вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов действия фармакологических препаратов, нейромедиаторов и гормонов и открывают весьма перспективный путь в изыскании веществ для оптимизации интеллектуально-мнестической деятельности мозга, направленной коррекции устойчивых патологических состояний, в генезе которых ведущими являются расстройства функции памяти.
Полученные в работе данные и сформулированные положения значительно расширяют наши представления о принципах нейрохимической организации процессов обучения и памяти; они могут найти применение в различных областях биологии и медицины, интересы которых требуют знания, молекулярных механизмов памяти.
Анализ характера изменений фосфорилирования HMG белков протеинкиназой N11 хроматина нейронов и глии в зависимости от действия антифеинов на транскрипционную активность вносит существенный вклад в понимание роли сАМР-независимых протеинкиназ и отдельных групп негистоновых белков в структурно-функциональных перестройках хроматина.
Помимо теоретического значения выполненное исследование представляет практическую ценность, поскольку в работе получены принципиально новые данные о молекулярных механизмах препарата ноотропного типа дейсшия этимизола и его структурных аналогов. Полученные результаты дают возможность более целенаправленно использовать антифеины в
s практической медицине, расширяют спектр эффективных стимуляторов долговременной памяти и способствуют разработке новых подходов к лечению больных с длительно текущими органическими и функциональными заболеваниями.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Для изучения молекулярных механизмов памяти в качестве
фармакологических зондов могут быть использованы антифеины - соединения с
близкой структурой, избирательным и разнонаправленным действием на
сохранение следа памяти.
2. Влияние модуляторов памяти из группы антифеина на
транскрипционную активность нейронов не определяется мембранными
рецепторами и системой вторичных посредников, а осуществляется на уровне
ядерных структур.
3. Антифеины оказывают прямое разнонаправленное влияние на комплекс
сАМР-независимая протеинкиназа Nil - негистоновый белок HMG 14. Это играет
пусковую роль в модулирующем влиянии этих веществ на транскрипционную
активность хроматина нейронов; противоположный характер наблюдаемых,
изменений определяется структурой этилнорантифеина и его аналогов.
4. В цепи биохимический событий, обеспечивающих сохранение
информации в долговременной памяти, необходимым 'этапом является
непосредственное воздействие нейроактивных веществ на функциональную
активность хроматина клеток головного мозга, что создает реальную основу для
целенаправленого изыскания эффективных ноотропиых средств.
Апробация работа. Материалы работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы временной организации клетки и их регуляция на различных уровнях" (Пущино, 1983), на IX и X Всесоюзных конференциях по биохимии нервной системы (Ереван, 1983, Горький, 1987), на Всесоюзном симпозиуме "Нейрохимические механизмы регуляции памяти" (Пущино, 1983), на 16 съезде европейских биохимических обществ (Москва, 1984), на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на I Всесоюзной конференции "Принципы и механизмы деятельности мозга человека" (Ленинград, 1985), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы разработки, изучения и производства лекарственных средств (Каунас, 1985), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы фармакологии, токсикологии нейротропных средств (Рига, 1986), на советско-итальянском симпозиуме по нейропсихофармакологии (Ташкент, 1986), на VI Всесоюзном съезде фармакологов (Ташкент, 1988), на Межреспубликанской научно-практической конференции "Синтез, фармакология и клинические аспекты новых психотропных средств" (Волгоград, 1989), на 28 совещании по проблемам
6 высшей нервной доп іепьности (Ленин рад, 1989), на Всесоюзной конференции "Биофизика мемЗсан' (Каунас, 1390), на V Всесоюзном симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра'1 (Гродно, 1990), на конференции "Медицина и биология сегодня и завтра", посвященная 100-петию ИЭМ (1990), на II международной конференции стран Балтии но фармакологии и клинической фармакологии (Таллинн, 1990), на Всесоюзной конфераїции "Фармакологическая коррекция гипоксических состоянии'1 (Гродно, 1991), на Междунчродной конференции "Нейрофармакология на рубеже двух тысячелетий" (С.Петербург, 1992), на 24 и 25 конгрессах Международного психоэндокринопогического общества (Таормина, Италия, 1993; Сиэтл, США, 1994), на I Международном конгрессе "Гормоны, мозг, нейропсихофармахология" (Родос, Греция, 1993).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 46 печатных работ.
Объем и структура работы. Диссертация содержит следующие разделы: введение, 3 главы, содержащие обзор литературы, материалы и методы, экспериментальную часть, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, библиографический указатель. Диссертация изложена на 2й5страницах машинописного текста, содержит 34 таблицы, 38 рисунков. В библиографическом указателе- 159 отечественных и 293 иностранных источника.
