Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Дрожжи рода Saccharomyces Meyen ex Reess 11
1.1.1. Краткая история систематики дрожжей рода Saccharomyces 11
1.1.2. Виды-двойники в комплексе Saccharomyces sensu stricto 14
1.1.3. Генетическая концепция рода дрожжей Saccharomyces 17
1.1.4. Идентификация дрожжевых культур 19
1.2. Плодово-ягодные вина 24
1.2.1. Классификация плодово-ягодных вин 24
1.2.2. Характеристика основных видов сырья для плодово-ягодного виноделия 27
1.2.2.1. Яблоки 29
1.2.2.2. Черная смородина 32
1.2.2.3. Малина 34
1.2.2.4. Черника . ! 35
1.2.2.5. Черноплодная рябина : 37
1.2.3. Современные тенденции производства плодово-ягодных вин и их
краткая характеристика 38
1.3. Дрожжи для плодово-ягодного виноделия 41
1.3.1. Основные расы дрожжей для производства яблочных вин 41
1.3.2. Основные расы дрожжей для производства ягодных вин 46
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 50
2.1. Объекты исследования 50
2.2. Материалы и методы 52
2.2.1. Физиологические тесты 52
2.2.2. Молекулярная дифференциация штаммов 55
2.2.3. Изучение динамики бродильной активности 58
2.2.4. Методы анализа ароматических веществ 62
2.3. Результаты 64
2.3.1. Физиологическое тестирование штаммов 64
2.3.1.1. Видовая идентификация штаммов 64
2.3.1.2. Определение максимальных температур роста штаммов 74
2.3.2. Молекулярно-биологическое тестирование штаммов 77
2.3.2.1. Молекулярная дифференциация штаммов 77
2.3.2.2. ПЦР с микросателлитным праймером (GTG)s 80
2.3.2.3. Молекулярное кариотипирование 81
2.3.3. Изучение динамики бродильной активности 89
2.3.3.1. Определение скорости и глубины сбраживания субстратов 89
2.3.3.2. Накопление этанола 94
2.3.3.3. Накопление биомассы дрожжей 97
2.3.3.4. Результаты газохроматографического анализа виноматериалов „ 102
Выводы 182
Список цитируемой литературы 185
Приложения 196
- Генетическая концепция рода дрожжей Saccharomyces
- Основные расы дрожжей для производства яблочных вин
- Методы анализа ароматических веществ
- Изучение динамики бродильной активности
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. По данным Департамента пищевой и
перерабатывающей промышленности Минсельхозпрода РФ, объемы
n производства винодельческой продукции в Российской Федерации за
f^! сырьевой базой всей виноградовинодельческой отрасли России. В результате
политики 80-х относительно производства и потребления алкоголя и
последующих, не всегда удачных, экономических преобразований
винодельческие предприятия страны в последние 10 лет оказались
практически без сырья. Поскольку с распадом СССР к России отошли лишь
некоторые винодельческие регионы, площади виноградных насаждений по всей стране сократились на 65-70%.
Большинство винодельческих предприятий России находятся в критическом положении, связанном с нехваткой виноградного сырья и
4 виноматериалов. Заводы вторичного виноделия России, ранее
использовавшие для производства вин сырье, закупаемое в республиках бывшего СССР, в настоящее время обеспечены виноматериалами не более, чем на 15-20% из-за значительного сокращения площадей под виноградом.
Мощности винодельческих предприятий загружены лишь на 15-20% и значительная часть сырья поступает за счет импорта из зарубежья. На сегодняшний день доля виноградного вина, произведенного из отечественного винограда, не превышает 30-40%. Взамен качественных виноградных вин предприятия предпочитают выпускать более выгодные
» винные напитки [Ханунов Э.Р., 1999; Оганесянц Л.А, 2001; Смирнов К.В.,
2002]. В тоже время РФ обладает надежной сырьевой базой для развития
**' промышленного производства высококачественных плодовых вин [Панасюк
а А.Л., 1992а].
5 Исследования последних лет подтвердили, что плодово-ягодные вина по
своему лечебному действию не уступают лучшим красным виноградным
винам благодаря высокому содержанию биологически активных веществ
(витаминов, флавоноидов) [Меньшов В.А. и др., 1998; Heinonen I.M. et.al.,
1998; Vuorinen Н. etal., 2000]. Поэтому их потребление и производство во
всем мире растет с каждым годом [Bradstock N., 2003].
Особенностью сырьевой базы плодово-ягодного виноделия является то, что климатические и почвенные условия России позволяют выращивать самые разнообразные виды плодов и ягод. Главные районы выращивания плодовых культур — Северный Кавказ и Центрально-Черноземный район, где сконцентрировано более 60% площадей и валового производства плодов и ягод. Существенную роль играют также хозяйства некоторых областей Центрального и Поволжского районов. В этих четырех районах получают около 90% урожая, поступающего на переработку [Панасюк А.Л., 1992а].
Для сбраживания различных плодово-ягодных соков рекомендуется использование соответствующих рас дрожжей, например, для черносмородинового сока - раса Черносмородиновая - 5 и 7, для яблочного -Яблочная - 7, Сидровая - 101 и т.д. Так, например, наиболее популярные марки советских плодово-ягодных вин - сухие яблочные вина «Предгорное» и «Яблоневый цвет», а также оригинальные яблочные вина с хересными тонами марки «Янтарное», наряду с внедрением новых технологических приемов, были созданы именно благодаря применению новейших рас дрожжей [Мехузла Н.А. и др., 1984; Панасюк А.Л., 1991].
Сейчас для производства плодово-ягодных вин в России и в других странах СНГ используется довольно ограниченный перечень рас дрожжей [Деменков А.П. и др., 1998], выделенных еще в конце 30-х годов и уже не отвечающих тем требованиям, которые предъявляют к ним современные технологии -скорость и полнота брожения, органолептические свойства и т.д.
Однако, в последние 20-30 лет поиск новых рас для плодово-ягодного виноделия практически не проводился, а за рубежом, за редким исключением
(Польша, Германия), совершенно отсутствуют специализированные расы дрожжей для плодово-ягодного виноделия.
Поэтому, в настоящее время назрела необходимость поиска новых рас дрожжей для производства яблочных и ягодных вин. В этой связи особого внимания заслуживает работа, которая совсем недавно была проведена в этом направлении в Беларуси, где из различных ягод было выделено свыше 500 штаммов дрожжей рода Saccharomyces, для сбраживания плодово-ягодных соков [Колесник И.М. и др., 2004].
Производство плодово-ягодных вин должно стать одним из приоритетных направлений отечественного виноделия и все исследования в данной области являются важными и актуальными.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основная цель диссертационной работы состоит в изучении физиолого-биохимических, молекулярных и технологических свойств 32 штаммов дрожжей рода Saccharomyces различного происхождения с позиции их использования в отраслях бродильных производств (первичном и вторичном виноградном и плодово-ягодном виноделии, шампанском и спиртовом производстве, пивоварении и хлебопечении) и селекции новых наиболее перспективных рас для плодово-ягодного виноделия. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Определение и описание морфологических и физиолого-биохимических характеристик дрожжевых штаммов, выделенных из плодового и ягодного сырья.
Определение видовой принадлежности исследуемых штаммов дрожжей на основе стандартных физиологических тестов (сбраживание Сахаров, ассимиляция).
3) Изучение термостабильности дрожжей с позиции их дальнейшего
использования для получения препаратов активных сухих винных дрожжей
(АСВД).
4) Видовая идентификация штаммов современными молекулярно-
биологическими методами анализа генома (ПЦР-анализ и молекулярное кариотипирование) и установление генетического родства изучаемых штаммов дрожжей.
5) Проведение лабораторных испытаний по изучению динамики сбраживания
плодово-ягодных субстратов новыми штаммами для плодово-ягодного
виноделия.
Определение основных физико-химических характеристик получаемых виноматериалов.
Характеристика суммы метаболитов при анаэробном способе жизни дрожжей.
Отбор плодово-ягодных штаммов, отличающихся наибольшей скоростью и глубиной сбраживания субстрата и дающих наибольший процент выхода спирта с единицы сахара и наиболее разнообразную композицию ароматических соединений.
9) Проведение сравнительных производственных испытаний отобранных
штаммов для плодово-ягодного виноделия.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ:
1) Изучены морфологические и физиолого-биохимические характеристики
изучаемых штаммов дрожжей. На основании стандартных физиологических
тестов установлено, что все изучаемые дрожжевые штаммы принадлежат к
одному биологическому виду Saccharomyces cerevisiae, хотя и отличаются
между собой по ряду признаков, обозначенных в определителе как
вариабельные.
2) Определены максимальные температуры роста дрожжевых штаммов и
выяснено, что наиболее термостабильными являются плодово-ягодные
культуры, что позволяет рекомендовать их к дальнейшему исследованию по
получению препаратов АСВД.
4) Проведена дифференциация штаммов современными молекулярно-
биологическими методами анализа генома с применением техники ПЦР-анализа, молекулярного кариотипирования и Саузерн-гибридизации. Показано, что пять культур, идентифицированных по физиологическим тестам как S. cerevisiae, являются межвидовыми гибридами S. cerevisiaex S. uvarum.
Определена динамика сбраживания плодово-ягодных субстратов новыми штаммами, выделенными с плодов и ягод культур Западного региона Беларуси.
В полученных плодовых виноматериалах определены основные физико-химические показатели и установлено, что все виноматериалы, полученные с применением новых плодово-ягодных культур, соответствуют требованиям ГОСТ 51146-98 «Виноматериалы плодовые сброженные и сброженно-спиртованные. Технические условия». В виноматериалах проанализированы основные ароматические компоненты.
Отобраны штаммы, которые показали наибольшую скорость и глубину сбраживания субстратов при наибольшем выходе спирта с единицы сахара.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:
В результате проведенных исследований изучены новые штаммы дрожжей для плодово-ягодного виноделия, их морфология, физиология, определена видовая принадлежность культур.
Освоен и предложен новый подход к идентификации дрожжевых культур, основанный на совмещении стандартных физиологических методов (первичная идентификация) и молекулярных методов анализа генома исследуемых культур.
3) Среди культур, идентифицированных ранее как S. cerevisiae, обнаружены
межвидовые гибриды S. cerevisiaex S. uvarum.
4) На основании изучения динамики сбраживания плодово-ягодных
субстратов, определения показателей выхода этанола с единицы сахара и
9 других химико-аналитических показателей полученных виноматериалов
отобраны 5 наиболее перспективных плодово-ягодных культур.
Проведено депонирование пяти отобранных плодово-ягодных штаммов во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ). Штаммам присвоены следующие коллекционные номера: ДЧК-1 - ВКПМ Y-3096, ГМ-8 - ВКПМ Y-3097, ГВ-4 - ВКПМ Y-3098, ВЧР-3 - ВКПМ Y-3099, ГСЧ-1-ВКПМУ-3100.
Подана заявка на получение патента на штамм S. cerevisiae ВКПМ Y-3097 для производства вин из ягод малины.
7) Проведены заводские испытания плодово-ягодных культур дрожжей в
филиале «Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г. Елец Липецкой области.
Испытания показали, что исследуемые дрожжевые штаммы обеспечивают
получение виноматериалов с более благоприятными органолептическими
свойствами по сравнению с контролем. Виноматериалы отличались более
насыщенным цветом, ярко выраженным сортовым ароматом и обладали
гармоничным и мягким вкусом. Расы отличаются высокими
технологическими показателями, позволяют интенсифицировать процесс
брожения, обеспечивая получение высококачественных виноматериалов.
Расы рекомендованы для использования на предприятиях плодового
виноделия. Результаты испытания подтверждены Актом из филиала
«Винзавода «Ключ жизни» ОАО «Бахус» г: Елец Липецкой области.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ:
Основные положения работы докладывались на международных конференциях: Международной конференции молодых ученых «Молодые ученые - пищевым и перерабатывающим отраслям АПК (технологические аспекты производства)» (Москва, 2000 г.) и П Международной научно-практической конференции «Качество, безопасность и экология пищевых продуктов и производств. Прогресс в области агроиндустрии» (Ялта, 2001 г.).
10 Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в
том числе 5 статей в сборнике «Актуальные вопросы пищевой
промышленности», в научно-производственных журналах «Виноделие и
виноградарство», «Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья», в
журнале «Микробиология». Проведено депонирование 5 штаммов дрожжей в
ВКПМ, подана заявка на получение патента РФ.
Генетическая концепция рода дрожжей Saccharomyces
Приведенная выше классификация сахаромицетов научно хорошо обоснована, но она не отражает полностью интересов микробиологов -производственников. Использованные в прошлом таксономические построения сахаромицетов возводили в ранг видов штаммы многих различных производств, тогда как дикие дрожжи-сорняки имели свои видовые названия. Это устраивало практиков. Дезориентируют прикладных микробиологов и постоянные ревизии рода Saccharomyces [Наумов Г.И., 1989]. Нет сомнений, что штаммы различных производств и их дикие родственники имеют существенные генетические различия, которые не должны учитываться в таксономических классификациях.
В отличие от бактерий, природные штаммы дрожжей, как и грибов вообще, классифицируют согласно кодексу ботанической номенклатуры [НаумовГ.И., 1989]. Наумовым [Naumov G.I., 1996] было предложено для названия культурных дрожжей и мицелиальных грибов воспользоваться кодексом номенклатуры растений. Согласно кодексу, рационально применять названия не для культиваров (штаммов), а для групп культиваров. В полном соответствии с кодексов были выбраны самые ранние латинские названия бывших таксонов, характерных для определенных производств или значимых для селекционной работы. Культурные штаммы биологического вида S. cerevisiae были разделены на шесть групп культиваров: Cerevisiae, Ellipsoideus, Cheresanus, Diastaticus, Logos и Oviformis. Биологический вид S. bayanus и гибридный таксон S. pastorianus имеют по одной группе культиваров, соответственно Uvarum и Carlsbergensis. Основные особенности указанных групп подробно описаны в литературе [Наумов Г.И., 1989].
Обобщение литературных сведений по биологической классификации видов дрожжей привело к созданию генетической концепции рода у этой группы организмов [Наумов Г.И. и др., 1989а]. На примере ряда родов (Metschnikowia, Kluyveromyces, Saccharomyces и др.) был сделан вывод, что род - это группа скрещивающихся между собой видов, гибриды которых размножаются только вегетативно. Сущность этой концепции генетического рода у эукариотических микроорганизмов заключается в том, что системы структурных и регуляторных генов видов одного рода совместимы в одном гибридном организме (диплоиде), а у разных родов — не совместимы. Это прежде всего относится к генам, отвечающим за половой процесс и кариогамию. Виды одного рода имеют одинаковую систему типов спаривания, позволяющую им скрещиваться.
На примере дрожжей Saccharomyces известно, что виды-двойники имеют одинаковое число хромосом и гомологичные хромосомы способны замещать друг друга, не смотря на их низкую химическую гомологию.
Биологические виды одного генетического рода скрещиваются между собой, но образуют стерильные гибриды с нежизнеспособными аскоспорами. [Наумов Г.И., 1997]. 1.1.4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДРОЖЖЕВЫХ КУЛЬТУР.
Технология виноделия базируется на жизнедеятельности дрожжей и биохимических превращениях ими углеводов винограда в основной продукт - этиловый спирт и вторичные продукты брожения.
Более глубокое изучение физиологии и биохимии дрожжей, а, следовательно, и более значимое использование их. в бродильных производствах стали доступны лишь после того, как были найдены и разработаны методы выделения микроорганизмов в чистые культуры. Для отбора лучших производственных рас дрожжей еще Луи Пастер начал заниматься освобождением их от сопутствующей микрофлоры — бактерий и слабо бродящих дрожжевых организмов. Но его культуры не были тогда еще в полном смысле слова чистыми и состояли, как указывал Ганзен, из смеси нескольких рас. Только в 1881 году Кох и независимо от него Ганзен впервые опубликовали разработанные ими надежные методы выделения микроорганизмов в чистые культуры. Изучая их свойства, Ганзен установил различия между расами дрожжей одного и того же вида. И хотя эти сведения имели непосредственное отношение к пивоварению, виноделы вскоре воспользовались предложенным методом и оценили роль чистых культур дрожжей в приготовлении вин [Бурьян Н.И. и др., 1997].
Развитие технологии производства вин предъявляло определенные требования к микробиологическим исследованиям, поскольку основной биохимический процесс при брожении виноградного сусла связан с условиями жизнедеятельности дрожжей и бактерий.
Поэтому, основная проблема микробиологии виноделия прошлых лет и настоящего времени, которой посвящены работы многих исследователей, — выделение чистых культур дрожжей, получение новых форм, их селекция и отбор наиболее ценных для производства.
Многие ученые считали, что культуры дрожжей определенного района виноделия более приспособлены к условиям местных вин и имеют преимущество перед расами других винодельческих регионов [Тюрина Л.В., 1962]. Однако, согласно углубленным исследованиям последних лет, представленным в зарубежной и отечественной литературе, для характеристики штаммов дрожжей более важно не место их выделения, а совокупность свойств, которыми они обладают [Мельникова В.А., 1992; TiborD., 1991].
Известно, что штаммы винных дрожжей различаются по скорости их размножения и сбраживания сусла, сульфито- и кислотовыносливости, термо- и холодостойкости, спиртообразующей способности, скорости осветления вина в связи с образованием пылевидных или хлопьевидных осадков и т.д.
Среди причин, побуждающих прибегать в виноделии к применению чистых культур дрожжей, помимо бродильных свойств важное место отводится особенностям рас дрожжей синтезировать то или иное количество вторичных и побочных продуктов брожения, которые существенно влияют на вкус и букет вина. [Настюков А.М., 1976; Бурьян Н.И. и др., 1997]. Современные новые и разносторонние подходы к исследованиям, развитие микробиологической техники открыли возможности более глубокого изучения микроорганизмов, и выявления ценных для виноделия качеств.
На основании изучения физиолого-биохимических особенностей различных штаммов дрожжей можно управлять процессом брожения и получать качественную продукцию, используя селекционные чистые культуры наряду с применением различных технологических приемов [Ховренко М.А., 1989;Rankine B.C., 1978; Reed G. etal., 1988].
Основные расы дрожжей для производства яблочных вин
Традиционно во всем мире сбраживание яблочных соков проводилось за счет естественной микрофлоры яблок, находящейся на поверхности [Зарубин В.А., 1962; Могилевский Н.К., 1970; Gillian М.Н. et al., 1985]. Эта традиция до сих пор сохранилась во Франции, где процесс брожения сидра осуществляется смешанной культурой микроорганизмов, представленной дрожжами рода Klokera, Metchnikovia, Saccharomyces, Hanseniaspora, Pichia, а также молочнокислыми бактериями родов Lactobacillus и Leuconostoc [Bowen J.F. et al., 1964; Salih A. et.al., 1998].
В идеале такая ассоциация микроорганизмов может обеспечить получение продукта самого высокого качества, поскольку каждая из ее составляющих выполняет свою положительную роль. Так, например, молочнокислые бактерии смягчают вкус вина за счет того, что превращают яблочную кислоту, придающую вину излишнюю резкость и тона незрелости в более мягкую молочную [Неггего М: et al., 1999а; 1999b]. Присутствие различных дрожжей-апикулятов благодаря наличию в них большого количества различных гидролитических ферментов повышает экстрактивность и насыщенность готового вина. Другим положительным аспектом присутствия дрожжей-несахаромицетов является их способность к синтезу большого количества различных летучих веществ, которые в значительной степени обогащают крайне бедную ароматику яблочного сока, придавая готовому вину необычные и пикантные тона [Michel A. et. al., 1988; 1990]. И, наконец, присутствие дрожжей рода Saccharomyces обеспечивает устойчивое спиртовое брожение, формирующее готовое вино [Amerine М.А. etal., 1968; Antonelli A. etal., 1999; Joshi V.K. et.al., 1994; 2000]. Учитывая, что микрофлора яблок может значительно варьировать в зависимости от их сорта, места произрастания, почвенно-климатических условий и ряда других факторов, учесть которые зачастую не представляется возможным, совершенно очевидно, что применение спонтанного брожения не может гарантировать стандартного качества готовой продукции и вместо высококачественного сидра можно было бы получить лишь посредственный яблочный виноматериал. В связи с этим во Франции проводятся исследования, направленные на создание искусственной ассоциации микроорганизмов, которую можно было бы использовать для получения высококачественного сидра в контролируемых условиях [Bizeau С. et. al., 1992]. Тем не менее, обеспечение стандартного качества готовой продукции пока не гарантирует только использование чистых культур дрожжей рода Saccharomyces, которые в последние годы нашли широкое применение во всех странах, производящих яблочные вина, в том числе и во Франции. К сожалению, в литературе практически отсутствуют данные о специализированных расах дрожжей, используемых для получения яблочных вин за рубежом. В обзорах, посвященных технологии яблочных вин в Германии, Англии и ряда других стран ЕС, указывается на то, что сбраживание яблочных соков можно проводить, используя активные сухие дрожжи (среди которых вообще нет препаратов для производства плодовых вин) или обычные винные дрожжи [Lea A.G., 1989; Reinenger М., 1998; Bradstock N., 2003]. В большинстве зарубежных исследовательских работ получение яблочных вин также проводилось с использованием сухих или обычных винных дрожжей, выбранных достаточно произвольно, без учета специфики яблочного виноделия [Joshi V.K. et.al., 1994; Herrero М. et.al, 1999а; Modi DR. et. al, 1998]. И только в отдельных исследованиях болгарских и польских ученых отмечалось использование рас дрожжей, специально предназначенных для яблочных вин [Tcorbanov В. et.al., 1993]. Судя по всему, в этих странах селекция специализированных дрожжевых культур для яблочного виноделия только начинается. Необходимость ее проведения там все же очевидна, поскольку даже те немногочисленные сравнительные исследования различных дрожжевых культур, которые были проведены за рубежом, показали значительные отличия между ними как по кинетике брожения, так и по накоплению различных ароматических веществ и других вторичных метаболитов [Leguerinel L et. al, 1989; Yavas I. et. al, 1992]. В России работа по выделению специализированных рас дрожжей для плодово-ягодного виноделия проводится уже очень давно. Так, еще в 1896 году А.М. Настюковым был дан подробный обзор результатов применения чистых культур плодовых дрожжей в виноделии [Саруханян Ф.Г., 1960]. В 1906 году Ф.В. Цереветинов, автор первого учебника по плодово-ягодному виноделию, рекомендовал для сбраживания яблочных соков использовать чистые культуры винных дрожжей [Цереветинов Ф.В., 1906]. В 20-30-е годы XX века в России был проведен массовый поиск новых культур дрожжей для получения плодовых вин. Наиболее значительными из них являются исследования В.И. Кудрявцева, проведенные им на Дальнем Востоке, в результате которых были выделены достаточно перспективные штаммы дрожжей для плодово-ягодного виноделия; а также работы Е.Н. Кирьяловой, отобравшей из микрофлоры плодов и ягод 36 наиболее активных штаммов дрожжей и показавшей их преимущество при сбраживании плодовых соков перед дрожжами, предназначенными для виноградных вин [Кудрявцев В.И., 1956; Саруханян Ф.Г., 1960].
Однако, наиболее плодотворными оказались исследования, проведенные в 1937-1938 годах Д.К. Чаленко, которому удалось выделить расы дрожжей, сразу же нашедшие широкое применение в практике плодово-ягодного виноделия и даже в настоящее время являющиеся основными для предприятий этой отрасли [Чаленко Д.К., 1948; Менузла Н.А. и др., 1984].
Методы анализа ароматических веществ
Анализ ароматических веществ осуществляли методами газовой хроматографии — масс-спектрометрии (ГХ-МС) и газовой хроматографии -пламенно-ионизационным детектором (ГХ-ПИД).
Условия проведения анализов: ГХ-МС НР-5988А фирмы Хьюлетт-Паккард (США). ГХ-ПИД HP- 5710 фирмы Хьюлетт-Паккард (США) с платой сбора, информации «Мультихром» фирмы «Амперсанд» (Россия). Газовая хроматография — масс-спектрометрия: 1. Кварцевая капиллярная колонка 50м .25мм .20мкм RSL - 150. Программирование температуры: 50,5 -280,57мин. Газ-носитель - гелий, Р=1,4атм. Режим инжектирования со сбросом 30 см3/мин и с задержкой сброса 1мин. 2. Кварцевая капиллярная колонка 50м .35мм .50мкм FFAP. Програмирование температуры: 40,5 -180,3/мин. Газ-носитель - гелий, Р=0,4атм. Режим инжектирования со сбросом 30 см3/мин и с задержкой сброса Гмин. Масс-спектрометрия: Квадрупольный анализатор. Режим сканирования по полному ионному току от 39 до 450 аем. Способ ионизации электронный удар 70EV. Температура ионной коробочки и интерфейса -200С и 250С. Данные масс-спектров обрабатывались на мс-станции НР-300, имеющей библиотеку масс-спектров объёмом 130000 единиц. Полученные масс-спектры сравнивались с библиотечными, а также в случае несоответствия библиотечного масс-спектра с масс-спектром аналита обрабатывались вручную.
Газовая хроматография — пламенно-ионизационный детектор:
1. Кварцевая капиллярная колонка 50м .25мм, 20 мкм RSL - 150. Программирование температуры:. 50,5 -280,57мин. Газ-носитель - азот, Р=1,4 атм. Режим инжектирования со сбросом 30 см3/мин и с задержкой сброса 1 мин.
2. Кварцевая капиллярная колонка 50м 35мм. 50мкм FFAP. Програмирование температуры: 40,5 -180,3/мин. Газ-носитель - азот, Р=0,4атм. Режим инжектирования со сбросом 30 см /мин и с задержкой сброса 1 мин.
Подготовка пробы к анализу: к 10 см3 вина добавлялось 1 мг внутреннего стандарта и 1 мкл аналита непосредственно инжектировалось в инжектор хроматомасс-спектрометра и хроматографа - пламенно-ионизационный детектор в режиме с задержкой и без задержки деления потока (Split/Splitless). Количественный анализ при ГХ-МС проводился по методу внутреннего стандарта. В ГХ-ПИД анализах для доступных компонентов результаты анализов рассчитывались по методу калибровочных кривых серии определяемых компонентов с использованием одного и того же количества внутреннего стандарта циклогексанола. Калибровочные кривые строились для каждого компонента по осям концентрация — отношение площадей пиков компонента к пику внутреннего стандарта. Диапазон калибровочных концентраций 1-10-25-50-100 и 1000 мг/дм3.
Опыты проводились в трехкратной повторносте. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по программе Excel 97 Microsoft Office. Результаты аналитических исследований подвергали математической обработке.-Уровень значимости во всех вычислениях принят равным 0,05. Анализ адекватности полученных уравнений осуществляли по t-критерию.
Изучение динамики бродильной активности
Целью данного раздела работы было исследование важнейших физиолого-биохимических свойств исследуемых дрожжевых штаммов: бродильной и генеративной активности, а также накопление спирта, глицерина, 2,3-бутандиола, фенилэтилового спирта, ацетальдегида, высших спиртов, эфиров и других ароматических веществ для отбора и дальнейшего использования штаммов в производстве вин из яблочных и различных ягодных сусел, являющихся как в России, так и Беларуси основным сырьем для производства плодово-ягодных вин.
1. Расы ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1, ГВ-4. На Рис. 7-14 отображена динамика выделения углекислоты при сбраживании виноградного сока и яблочного сусла соответственно штаммами ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1 и ГВ-4, выделенными с виноградных ягод.
Результаты показывают, что виноградные штаммы обладают достаточно высокой энергией брожения и сбраживают виноградное сусло за 10-20 дней. Брожение на яблочном сусле проходило за более длительный период - 19-27 суток. Содержание остаточного сахара у всех виноматериалов, полученных при брожении на расах ВВ-1, ВВ-2, ГВ-1 и ГВ-4, не превышает 0,31 г/100см3, что соответствует требованиям, предъявляемым по этому показателю к виноградным и яблочным виноматериалам [ГОСТ 7208-93, ГОСТ 51146-98].
При сбраживании виноградного сусла отмечается более высокое образование углекислоты за меньший период времени. Все 4 штамма характеризуются практически одинаковой бродильной активностью, т.к. в результате брожения количество образованного ими СОг составляет 15,0 г/100 см3 для рас ВВ-1 и ГВ-1 и 15,05 г/100 см3 - для рас ВВ-2 и ГВ-4: Все четыре штамма обеспечивают энергичное забраживание субстрата. Наиболее активно проявил себя штамм ВВ-1 (Рис.7). Он обеспечивал как энергичное забраживание субстрата, так и его быстрое дображивание. Весь процесс брожения с участием штамма ВВ-1 проходил за 10 суток. Несколько уступают ему штаммы ВВ-2 (Рис.8) и ГВ-4 (Рис.10), которые, хоть и начинают процесс брожения более энергично, уже на вторые сутки начинают отставать от расы ВВ-1 и полностью сбраживают субстрат за 11 суток. Штамм ГВ-1 (Рис. 9) отличается наименьшей бродильной активностью, позволившей завершить весь процесс брожения за 20 суток.
При сбраживании яблочного сусла наиболее энергичное его забраживание наблюдалось при использовании штамма ВВ-2 (Рис. 12), который на протяжении первых 5 суток обеспечивал наибольшее накопление углекислоты, однако дальнейшее сбраживание данного субстрата этот штамм проводил очень вяло, в результате чего длительность брожения на расе ВВ-2 составила 27 суток. Общее накопление Cd при использовании этой расы было наибольшим и составило 15,05 г/100 см3. Напротив, штаммы ГВ-1 (Рис.13) и ГВ-4 (Рис. 14), хотя и сбраживали яблочное сусло менее энергично, тем не менее процесс дображивания проводили гораздо быстрее, что позволило им накопить 15,0 г C(V 100 см3 за 20 суток (ГВ-1) и 14,47 г СОг/ 100 см за 19 суток (ГВ-4). Наименьшей бродильной активностью характеризовался штамм ВВ-1 (Рис. 12), который выбраживал яблочное сусло в течение 24 суток с накоплением углекислоты в количестве 14,65 г/100 см3.
2. Расы ГСЧ-1, ГСЧ-5, ГСЧ-8, ГСЧ-11. Данные, представленные на Рис. 15-22, показывают, что штаммы дрожжей, выделенные с ягод черной смородины, обладают достаточно высокой энергией брожения поскольку полностью сбраживают как черносмородиновое, так и яблочное сусло всего за 14-20 суток. При этом, содержание остаточного сахара у всех полученных виноматериалов не превышает 0,30 г/100 см3, что соответствует требованиям, предъявляемым по этому показателю к черносмородиновым и яблочным виноматериалам [ГОСТ 51146-98].
При сбраживании черносмородинового сока изучаемыми штаммами отмечалось несколько более высокое образование СОг. Наиболее активно проявил себя штамм ГСЧ-1 (Рис. 15). Он обеспечивал как энергичное забраживание черносмородинового сока, так и его быстрое дображивание. Несколько уступает ему штамм ГСЧ-11 (Рис.18), который начинал процесс брожения медленнее, но уже на 6-е сутки даже опережал штамм ГСЧ-1 по интенсивности накопления СОг. Однако, процесс дображивания этот штамм проводил достаточно медленно, из-за чего весь процесс брожения с его участием проходил за 20 суток (у ГСЧ-1 - за 14 суток). Штамм ГСЧ-5 (Рис.16) отличается более медленной, но ровной кинетикой брожения, позволившей завершить брожение на 17-е сутки. И, наконец, наименьшей бродильной способностью характеризуется штамм ГСЧ-8 (Рис.17), который хотя и заканчивал процесс брожения на 17-е сутки, тем не менее, количество образованного им СОг было наименьшим и составило 14,27 г/100 см сока, по сравнению с 14,92 г/100 см3 для штаммов ГСЧ-1 и ГСЧ-11 и 14,80 г/100 см3 для штамма ГСЧ-1.
При сбраживании яблочного сусла наиболее энергичное его забраживание наблюдается при использовании штамма ГСЧ-11 (Рис.22), который в течение первых 10 суток обеспечивал наибольшее накопление СОг, однако, также как и в случае с черносмородиновым соком, дображивание этот штамм проводил очень вяло, в результате чего суммарное накопление СО2 при брожении на этой расе было наименьшим (13,30 г/100 см3). Напротив, штаммы ГСЧ-1 (Рис.19) и ГСЧ-8 (Рис.21), хотя и сбраживали яблочное сусло менее энергично, тем не менее процесс дображивания они проводили быстрее, что позволило им накопить 14,75 г СОг /100 см3 за 16 суток (ГСЧ-1) и 14,80 г СОг /100 см за 15 суток (ГСЧ-8). Наименьшей бродильной активностью характеризуется штамм ГСЧ-5 (Рис.20), который сбраживал сусло в течение 21 дня с накоплением 14,60 г СО2 /100 см3.
3. Расы ГМ-8, ГМ-15, ГМ-17. Динамика выделения СОг при сбраживании малинового сусла штаммами ГМ-8, ГМ-15 и ГМ-17 представлена на Рис. 23-28. Совершенно очевидно, что штаммы этой группы обладают более низкой энергией брожения, поскольку сбраживают как малиновый сок, так и яблочное сусло за 16-30 суток. Кроме того, содержание остаточного сахара в малиновом виноматериале, полученном с использованием расы ГМ-17, превышает допустимое по ГОСТ 51146-98 значение - 0,5 г/100 см - и составляет 0,6 г/100 см .
При сбраживании малинового сока исследуемыми штаммами отмечалось несколько более энергичное образование углекислоты. Наиболее энергичное забраживание малинового сусла наблюдается при использовании расы ГМ-17, которая первые 3 суток более интенсивно сбраживала субстрат (Рис.25), однако, процесс дображивания этот штамм проводил достаточно медленно, из-за чего весь процесс брожения с его участием проходил за 30 суток. За этот период накопление СОг составило 15,17 г/100 см3. Вторым по длительности сбраживания малинового сока является штамм ГМ-15, который начинал процесс брожения чуть менее энергично, чем штамм ГМ-17, однако дображивание проводилось им намного интенсивнее, и весь процесс брожения был завершен за 19 суток (Рис. 24). Тем не менее количество образованного им СОг было наименьшим и составило 14,15 г/100 см малинового сусла. Штамм ГМ-8 (Рис. 23) характеризуется схожей с ним кинетикой брожения, позволившей, однако, завершить брожение на 16 сутки, накопив при этом 14,35 г CChJ 100 см3.
