Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Акифьев Борис Николаевич

Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего
<
Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Акифьев Борис Николаевич. Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.04 : СПб., 2004 105 c. РГБ ОД, 61:05-3/821

Содержание к диссертации

1. ВВЕДЕНИЕ 4

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

2.1.АПОЛИП0ПРОТЕИН A-I ЧЕЛОВЕКА: СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА 9

2.2. СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНА АРО A-I ЧЕЛОВЕКА... 10

2.3. МЕТОДЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 17

2.3.1. Перенос ДНК in vitro (перенос в культуру клеток) 19

2.3.1.1 Кальций-фосфатная преципитация 19

2.3.1.2 Липофекция , 19

2.3.1.3 Электропорация 20

2.3.1.4 Применение молекулярных конъюгатов 21

2.3.1.5 Перенос генов с помощью рекомбинантных вирусов 24

2.3.2. Перепое ex vivo 24

2.3.3. Перенос генов in vivo. 25

2.3.3.1 Перенос с помощью рекомбинантных вирусов 25

2.3.3.2 Использование для доставки генов in vivo липофекции 28

2.3.3.3 Перенос генов в составе комплексов с поликатионами или с конъюгатами поликатионов и лигандов клеточных рецепторов 29

2.3.3.4 Инъекции и иные физико-химические способы доставки ДНК в организм 31

2.3.3.5 Доставка ДНК в организм животного методом

гидродинамических внутривенных инъекций 32

2.4.РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ГЕНОТЕРАПИИ ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИИ И АТЕРОСКЛЕРОЗА НА ОСНОВЕ ДОСТАВКИ ГЕНА АРО А-1 В ОРГАНИЗМ 35

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 41

3.1. МАТЕРИАЛЫ и ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 41

3.2. СИНТЕЗ ГАЛАКТОЗИЛИРОВАННОГОПОЛИ-Ь-ЛИЗИНА 42

3.3. ТРАНСФОРМАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, НАКОПЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ГШАЗМИД,МЕЧЕНИЕҐПІЕПАРАТОВДНК 42

3.4. ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ ДНК - ГАЛАКТОЗИЛИРОВАННЫЙ ПОЛИ-Ь-ЛИЗИН 3.5.ТРАНСФЕКЦИЯ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ КЛЕТОК И АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ-МАРКЕРОВ В ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КЛЕТКАХ 43

3.6. ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЮЦИФЕРАЗЫ 44

3.7. КОНКУРЕНТНОЕ ВЫТЕСНЕНИЕ АДСОРБИРОВАННЫХ НА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ МЕЧЕНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДНК - POLY(L-LYS)GAL ИЗБЫТКАМИ НЕМЕЧЕНОГО КОНЪЮГАТА 44

3.8. ВНУТРИВЕННЫЕ ИНЪЕКЦИИ КОМПЛЕКСОВ ДНК - POLY{L-LYS)GAL В

ХВОСТОВУЮ ВЕНУ КРЫСАМ 44

3.9. ВНУТРИВЕННЬШИНЬЕЩИИгаїАЗМИДВДЙДНК В ХВОСТОВУЮ ВЕНУ МЬШІАМ 3.10. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК из ТКАНЕЙ ЖИВОТНОГО И АНАЛИЗ ЧУЖЕРОДНЫХ

НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В СОСТАВЕ ДНК КРЫС И МЫШЕЙ, ПЦР АНАЛИЗ 45

ЗЛ1.ВЬ1ДЕЛЕНИЕРНКИРЕТРО-ГШР 45

3.12.«СПАСЕНИЕ» ПЛАЗМИДНЫХ ДНК ИЗ ЯДЕР КЛЕТОК ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ 46

3.13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЫШЕЙ И КРЫС ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО APO А-І И АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К АРОА-І ЧЕЛОВЕК А 46

3.14. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 47

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 48

4.1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ POLY(L-LYS)GAL ДЛЯ ДОСТАВКИ ДНК В КЛЕТКИ

ГЕПАТОЦИТАРНОГО РЯДА 4.1.1. Поиск оптимальной величины соотношения конъюгатДНК; формирование комплексов для трансфекции клеток и инъецирования 48

4.1.2. Трансфекция культивируемых ггпатомных клеток комплексами ДНК- галактозтировапный поли Ь-лизин 50

4.1.3. Определение оптимальной величины ионной сичы в реакционной среде при образовании комплексовpoly(L lys)Gal/ДНК 54

4.1.4. Анализ специфичности связывания комплексов poly(L-Lys)Gal/ffHK асиалогликопротеиновыми рецепторами клеток HepG2 56

4.1.5. Доставка гена аролипопротеина A-I человека в комплексе с галактозшированным поли Ь-лизино.\{ в печень крыс 57

4.1.6. Вектор экспрессии гена ароА-1 человека сохраняется в ядрах клеток печени в виде описомы 60

4.2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИЗИН-БОГАТЫХ И АРГИНИН-БОГАТЫХ ПЕПТИДОВ ДЛЯ ДОСТАВКИ ДНК В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 63

4.3. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА АРО А-1 ЧЕЛОВЕКА В ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ ДОСТАВКИ ЕГО

МЫШАМ МЕТОДОМ ВНУТРИВЕНКЬ1ХЩДГОДШ1АМИЧЕСКИХИт,ЕКЦИЙ 67

4.3А. Влияние комплексообразования ДНК с катионными пептидами на

эффективность гидродинамического переноса 68

4.3.2. Сравнение характера экспрессии гена аро А-1 в зависимости от интронно-жзониой структуры 69

4.3.3. Оценка эффективности экспрессии гена люциферазы под контролем гепацитарпого энхансера аро А-1 в переживающих клетках печени мышей. 75

4.3.4. Анализ присутствия гена аро А-1 в ядерной низкомолекулярной ДНК клеток печени мышей 77

4.3.5. Оценка гуморального иммунного ответа у мышей на введение плазмиды pAlg. , 79

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 81

6. ВЫВОДЫ. 83

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 

Введение к работе

Сердечно-сосудистые заболевания, в частности ишемическая болезнь сердца (ИБС), широко распространены в развитых странах Европы и Америки и являются наиболее частой причиной смерти людей пожилого возраста. Атеросклероз - одна из главных причин ИБС - и его развитие, в свою очередь, обусловливается различными факторами риска. Характерным показателем развития атеросклероза является снижение содержания в крови больных липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) - «антиатерогенных» липопротеидов, и повышение содержания липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) - «атерогенных» липопротеидов. В работах А. Н, Климова с сотрудниками (см. монографию (Климов А. Н. и др., 1995)) впервые было уделено внимание антиатерогенным свойствам ЛПВП и рассмотрена возможность использования ЛПВП и их главной белковой составляющей - аполипопротеина A-I (аро A-I) в лечебных целях.

Антиатерогенные свойства человеческого ароА-1 были убедительным образом продемонстрированы в экспериментах с трансгенными животными, которые приобретали устойчивость к атерогенным нарушениям стенок сосудов после трансплантации в геном человеческого гена аро A-I (Rubin Е. М. et al., 1991а; Rubin Е. М. et al., 1991b; Shorter R. et al., 1990; Swanson M. E. et al., 1992; Thompson L., 1992). Создание экспериментальной базы генотерапии ряда наследственных заболеваний человека и клиническая апробация этих подходов в ведущих мировых медико-биологических центрах позволили вплотную подойти к разработке аналогичных методов и для лечения других тяжёлых заболеваний, включая приобретаемые с возрастом сердечно-сосудистые болезни.

В круг проблем, общих для решения вопросов генотерапии, входит повышение эффективности и длительности работы в организме больного генетических конструкций, содержащих «лечащий» ген, а также устранение токсичности, иммуногенности, и иных побочных действий средств переноса «лечащих» генов пациенту (Culver К. W., 1994). По сути дела, решение этих проблем сводится к оптимизации используемых векторов экспрессии «лечащих» генов и к разработке эффективных средств доставки, лишенных указанных недостатков.

Эффективность генотерапевтического подхода к лечению атеросклероза путем доставки в организм млекопитающего гена аро А-1 показана в исследованиях по переносу гена аро А-1 человека лабораторным животным с атеросклеретическими повреждениями сосудов, индуцированными холестериновой диетой (Luoma Р. V., 1997; Tsukamoto К. et al., 1997; De Geest B. et al., 2000; Benoit P. et al., 1999; Tangirala R. K. et al., 1999; Belalcazar L. M. et al., 2003). На основании полученных результатов разрабатываются схемы лечения больных атеросклерозом, находящиеся на стадии предклинических испытаний (Belalcazar L. М. et al., 2003).

Вместе с тем, следует отметить, что хотя широко используемые в настоящее время вирусные способы переноса «лечащих» генов (в рекомбинантных аденовирусах) наиболее эффективны, они не лишены побочных эффектов, главными из которых являются токсичность и иммуногенность рекомбинантных вирусов, ограничивающих их повторное использование для целей лечения. Невирусные средства доставки, несмотря на их низкую эффективность, лишены указанных недостатков и могут использоваться неоднократно, что весьма важно для лечения длительно текущих заболеваний, к которым относится и атеросклероз.

Таким образом, весьма актуальным является разработка таких подходов к генотерапии атеросклероза, при которых однократное воздействие имело бы оптимальный и продолжительный эффект и одновременно не исключало бы возможность повторения генотерапевтической процедуры. Подобный подход должен сочетать использование оптимизированных генетических конструкций и невирусных способов их доставки в организм больного.

Цель работы - сравнить различные невирусные способы переноса гена аполипопротеина A-I человека в клетки млекопитающих in vitro и in vivo и изучить особенности экспрессии гена аро A-I человека в чужеродном окружении в зависимости от его структурно-функциональной организации.

Для достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:

1) исследовать возможности использования галактозилированного поли-L-лизина, а также катионных пептидов для переноса экспрессирующегося гена аро A-I человека в печень млекопитающих (крыс) и оценить эффективность работы этих носителей в сравнении с использовавшимися ранее;

2) применить для доставки плазмидных векторов экспрессии гена человеческого аро A-I в организм млекопитающих (мышей) метод гидродинамических инъекций «голой» ДНК и сравнить эффективность этого способа с доставкой ДНК в виде комплексов с молекулярными коньюгатами и катионными пептидами;

3) сравнить эффективность и длительность экспрессии гена человеческого аро A-I в печени мышей в зависимости от структурно-функциональной организации этого гена (наличия экзонно-интронной структуры и участков регуляции транскрипции). Основные положения, выносимые на защиту

1. Перенос плазмидной ДНК в полиэлектролитном комплексе с галактозилированным поли-Ь-лизином - poly(L-Iys)Gal в культивируемые клетки гепатомы человека HepG2 происходит рецептор-опосредованным эндоцитозом. Эффективность доставки плазмидных векторов экспрессии в комплексе с poIy(L-lys)Gal в культивируемые клетки гепатомы человека HepG2 сравнима с эффективностью доставки плазмидных ДНК методом кальций-фосфатной копреципитации и зависит от молярного соотношения ДНК : poly(L-lys)Gal в комплексе.

2. Плазмидный вектор экспрессии кДНК аро A-I человека, инъецированный в комплексе с poly(L-lys)Gal в хвостовую вену крыс, доставляется в клетки печени и сохраняется в ядрах клеток в виде эписомы по меньшей мере в течение недели. Уровень аро A-I человека в крови крыс может быть повышен путём повторных внутривенных инъекций указанных комплексов.

3. Доставка векторов экспрессии гена аро A-I человека в печень мышей С57В1/6 путём гидродинамических внутривенных инъекций соответствующих плазмидных ДНК обеспечивает высокое содержание человеческого аро A-I в сыворотке крови животных. Уровень аро A-I человека в крови МЬШІЄЙ может быть повышен повторными внутривенными инъекциями плазмидной ДНК.

4. Гидродинамическое введение комплексов ДНК с катионным пептидом Tat приводит к заметному снижению эффективности переноса по сравнению с введением «голой» ДНК.

5. Человеческий белок аро А-Ї спустя 2 недели после инъекций гена мышам не стимулировал появления специфичных антител в крови животных.

6. Динамика экспрессии гена аро A-I человека в печени мышей не зависит от типа промотора, а определяется организацией структурной части гена Сохранение экзонно-интронной структуры гена аро A-I обеспечивает эффективную и более продолжительную (до б месяцев) экспрессию гена в сравнении с экспрессией его кДНК-копии.

Научная новизна работы

Впервые была показана возможность доставки векторов экспрессии гена аро А-1 человека в организм млекопитающего путём внутривенных инъекций комплексов плазмидной ДНК с poly(L-lys)Gal, причем было установлен факт продолжительного сохранения доставленной ДНК в клетках печени в виде эписомы. В результате гидродинамических внутривенных инъекций плазмидных векторов экспрессии гена аро А-1 человека мышам C57BI/6 оказалось возможным получить длительную и эффективную экспрессию перенесённого гена в клетках печени, а за счёт повторных инъекций добиться повышения уровня аро А-1 человека в крови животных.

Продолжительность и уровень экспрессии гена аро А-1 человека в клетках печени мышей (в чужеродном окружении) в значительной мере определяется не видом промотора (вирусоспецифический или клеточный), а экзонно-интроиной структурой кодирующей части гена, что является абсолютно новым фактом, имеющим приоритетное значение.

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты указывают на возможность использования различных катионных носителей как основы для эффективной доставки ДНК в клетки млекопитающих. Вместе с тем, отрицательные данные, полученные по доставке путём внутривенных инъекций в организм генов-маркеров и гена аро А-1 человека в комплексе с немодифицированными катионными пептидами, указывают на существование определённых факторов, ограничивающих использование этого способа для практических задач генотерапии атеросклероза. Более перспективным является способ гидродинамических инъекций «голой» ДНК, который может быть адаптирован для целей генотерапии атеросклероза в дальнейшем. Весьма важно в каждом конкретном случае учитывать также структурно-функциональную организацию доставляемого в организм гена. В нашем случае важным для продолжительной и эффективной экспрессии оказалось сохранение экзонно-интронной структуры гена аро А-1 человека.

Результаты настоящего исследования могут быть использованы при разработке и реализации проекта, направленного на лечение атеросклероза путем генетической коррекции соотношения антиатерогенных и атерогенных липопротеидов в крови пациентов.

Материалы диссертации используются в курсах лекций для бакалавров и магистров кафедр эмбриологии и биохимии Санкт-Петербургского государственного университета.

Личный вклад

Основная часть экспериментов выполнена диссертантом. Культивирование и трансфекция клеток млекопитающих выполнялись совместно с вед. н. с, к. б. н. Э. Б. Диже. Синтез галактозилировакного поли-Ъ-лизина производился совместно со ст. инж. Б. В. Миссюлем.

Апробация работы По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 10 тезисов докладов и сообщений на всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и съездах. Результаты работы докладывались на международной конференции «Human Genome» (Australia, 1999), ежегодных итоговых конференциях ПП «Геном Человека» ГНТП РФ, съездах биохимического общества России (1997, 2002 гг.), международных конференциях «СПИД, рак и родственные проблемы» (1997, 1999 гг.), международной конференции "Рецепция и вігутриклеточная сигнализация" (Пущино, 1998 г.), и других конференциях.

Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 105 страницах текста, иллюстративный материал содержит 20 рисунков и 1 таблицу. Список литературы содержит 224 наименования, из них 210 на иностранном языке. 

Похожие диссертации на Особенности экспрессии гена аполипопротеина A-l человека после его переноса в организм млекопитающего