Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследование отдельных звеньев клеточного метаболизма является одной из важнейших задач современной биологии. Оно імеет теоретическое и практическое значение, так как позволяет приблизиться с пониманию механизмов функционирования организма как целостной :истемы и, благодаря этому, создает условия для решения проблем, связанных : повышением устойчивости живых организмов к неблагоприятным факторам. 3 этом направлении проводится немало исследований, но многие аспекты, ;вязанные, например, с регуляцией и сопряжением отдельных процессов, ззучены недостаточно. Это относится и к метаболизму сукцината, в частности, і период интенсивного функционирования глиоксилатного цикла. Принято :читать,' что интенсивно образующийся в этих условиях сукцинат, далее зкисляется в отрезке цикла Кребса до оксалоацетата и последний вступает в "лйкойеогенез: Однако нет данных о том, сбалансирован ли скорость -лиоксисомальных и иитохондриальных процессов, особенно в период максимальной активности глиоксилатного цикла. Кроме того известно, что им функционирования глюконеогенетического пути необходимо высокое удержание восстаноатенных пиридиннуклеотадов и АТФ в клетке, тормозящее работу элекгронгранспоргной цепи митохондрий и, ^ответственно, сукцинатдеищрогеназного комплекса. Таким образом, есть Основания предполагать наличие альтернативных путей окисления сукцината в гериод прорастания масличных семян.
Важным представляется решение вопроса о путях электронного транспорта при окислении сукцината в активно дышащих тканях проростков зысших растений. Наличие в растительных митохондриях альтернативной жсидазы определяет возможность либо сопряженного окисления сукцината іерез цитохромный путь, либо быстрое несопряженное окисление через шьтернативнуто оксидазу. Кроме того функционирование митохондрий в условиях высокого соотношения НАДН/НАД+ и АТФ/АДФ и высокого мембранного потенциала может приводить к генерации восстановленных рорм кислорода, способных повреждать митохондриальную ДНК. Этот троцесс и наличие защитных механизмов остаются малоисследованными для эастительных митохондрий.
Особый интерес представляет организация метаболизма янтарно; кислоты в микротельцах. Процесс мобилизации запасных жиров дл глюконесгенеза, по-видимому, протекает во всех живых организмах. Однакс для тканей высших животных биохимический механизм данного процесс
остается невыясненным. Наличие ферментов (3-окисления жирных кислот животных пероксисомах позволяет предположить возможность индукциі ферментов глиоксилатного цикла, позволяющих конденсировать две молекулі
ацетил-КоА, образующегося при р-окислении, в сукцинат.
Для создания целостной картины процессов, происходящих в клетке
необходимо изучение всех метаболических путей, сопряженных с тем ил
иным веществом, исследование физических, химических и физиологически
свойств отдельных ферментативных систем. В клетках сукцинат образуется і
утилизируется при работе ферментов, обеспечивающих функционировани
центральных метаболических путей: сукцинатдегидрогеназы, сукцинил-КоА
синтетазы, изоцитратлиазы и дегидрогеназы полушіьдегида янтарной кислоть:
То есть сукцинат яшіяется важным связующим звеном процессов дыхания
глюконеогенеза и биосинтеза аминокислот. Множественное!
ферментативных реакций, связанных с одним субстратом - сукцинатом, по видимому, может обеспечивать тонкую регуляцию анаболических і катаболических процессов, поддерживающих внутриклеточный гомеостаз условиях изменения окружающей среды.
Цель и задачи исследовании. Целью данной работы являлось изучени организации и ферментативной регуляции метаболизма сукцината растительной и животной клетках в условиях его интенсивного образования, также исследование физико-химических, каталитических и регуляторны свойств отдельных ферментных систем, участвующих в этом процессе.
Исходя из цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить особенности метаболизма сукцината в процессе прорастани семян, отличающихся природой и структурой запасающих органов.
-
Исследовать возможность функционирования альтернативных путе: окисления сукцината в условиях его интенсивного образования.
-
Определить пути электронного транспорта при окислении сукцината митохондриях различных тканей высших растений.
-
Выявить возможность генерации восстановленных форм кислорода в іститєльньіх митохондриях и участие альтернативной оксидазы в этом роцессе.
-
Изучить возможность индукции ферментов глиоксилатного цикла в санях высших животных в условиях, вызывающих мобилизацию запасных иров (при голодании).
-
Разработать способы получения высокоочищенных препаратов ерментов, участвующих в метаболизме сукцината из различных источников.
-
Исследовать кинетические, физико-химические и регулягорные зсйства ферментов, метаболизирующих янтарную кислоту.
Научная новизна работы. При изучении метаболизма сукцината оказано, что его интенсификация связана с работой глиоксилатного цикла зк в растительных, так и в животных тканях. Показано, что интенсивное эразование янтарной кислоты приводит к значительным изменениям етаболических путей, связанных с ее утилизацией. Так при прорастании :мян злаковых функционирует впервые обнаруженная нами шоксисомальная сукцинатоксидаза, основной функцией которой является ыстрое, не связанное с запасанием энергии окисление сукцината елосредственно в глиоксисомах, позволяющее снять аденилатный контроль тектронтранспортной цепи митохондрий. В эндосперме клещевины при рорастании в период интенсивной работы глиоксилатного цикла происходит [унтирование цикла Кребса через аминогрансферазные реакции, что озволяет обойти лимитирующие этапы и также способствует интенсивной етаболизации сукцината.
Для печени крыс впервые показана индукция при голодании ферментов шоксилатного цикла, позволяющая мобилизовывать жиры и через сукцинат аправлять их на глюконеогенез или поддержание энергетического баланса петки. Впервые установлено, что ключевые ферменты глиоксилатного цикла -зоцитратлиаза и малатсинтаза . локализованы в микротельцах животных <аней. Наличие в этих органоидах ферментов В-окисления жирных кислот озволяет считать их полноценными глиоксисомами. Впервые получен шогенный препарат изоцитратлиазы из животной ткани, изучены его изико-химические свойства и показана регуляция активности данного ермента сахарофосфатами.
При изучении путей электронного транспорта при окислении сукнината в растительных митохондриях показано, что основной поток электронов в жирозапасающих тканях идет через цианидрезистентную альтернативную оксидазу. Впервые обнаружено, что ингибирование атьтернативной оксидазы приводит к значительному увеличению интенсивности генерации перекиси водорода митохондриальной электронтранслортной цепью, то есть альтернативная оксидаза может выступать защитным механизмом от образования восстановленных форм кислорода.
Практическая значимость исследования, Научные положения настоящей работы расширяют и углубляют современные представления о механизмах сопряжения анаболических и катаболнческих процессов в растительной и животной клетках. Разработанная схема выделения электрофоретически гомогенного препарата изоцитратлиазы может быть использована для получения коммерческих препаратов фермента. Найденный метод стабилизации фермента позволяет сохранять ею активность в течение длительного времени, что обеспечивает возможность использования препарата изоцитратлиазы доя медицинской диагностики и в биохимических исследованиях для количественного определения изоцитрата.
Обнаружение феномена индукции глиоксилатного цикла при голодании в печени высших животных может служить основой для' разработки" тест-систем обнаружения нарушений обмена веществ, связанных с мобилизацией запасных жиров. На основе полученных данных о существовании альтернативной глиоксисомальной сукцинатоксидазы, специфичной для растений семейства злаковых, возможна разработка гербицидов, частично ингибирующих основной путь окисления сукцината - сукцинатдегидрогеназу и подавляющих развитие растений, не обладающих альтернативной системой окисления янтарной кислоты.
Материаты работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского госуниверситета. Результаты исследований вошли в курсы лекций по "Биохимии", "Дыханию растений".
Апробация работы. Материалы работы были представлены и обсуждались на IX (Брно, Чехия, 1994 г.) и X (Флоренция, Италия, 1996) Конгрессах Федерации европейских обществ физиологов растений; 2-ом ежегодном симпозиуме Всероссийского общества физиологов растений (Пенза, 1996); 2-
й Международной конференции "Кислород и свободные радикалы в астениях" (Вена, Австрия, 1996); Международном симпозиуме "Физико-тмические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 595); Международном совещании "Дыхание растений: физиологические и шлогические аспекты" (Сыктывкар, 1995); научной сессии Воронежского эсударственного университета (1996). Работа является победителем XXXII и XXIII Международной научной студенческой конференции Новосибирского юуниверситета (1994, 1995 гг.) и Лауреатом Премии администрации оронежской области для молодых ученых за 1995 год.
Структура диссертации. Диссертационная работа включает 6 глав, 190 границ, 32 рисунка, 14 таблиц. В работе использовано 343 литературных сточника.
