Содержание к диссертации
Стр.
I. ВВЕДЕНИЕ 6
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА I. ОСОБЕННОСТИ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ГИСТОНОВ
Особенности первичной структуры гистонов 9
Функции гистонов 12
ГЛАВА 2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГИСТОНОВ
2.1. Взаимодействие коровых гистонов и структура
продуктов их ассоциации 17
Взаимодействие олигомеров коровых гистонов с ДНК .... 25
Структура и взаимодействие гистона НІ 30
ГЛАВА 3. СБОРКА НУКЛЕОСОМ ПРИ РЕПЛИКАЦИИ ХРОМАТИНА 33
III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы 37
Методы
Выделение ядер и хроматина из тимуса теленка 38
Выделение хроматина из семенников и
сперматозоидов карпа 39
4.2.3. Выделение суммарных гистонов, гистона HI
и смеси Кировых гистонов 40
Выделение нативных олигомеров гистонов: октамера ДШ-Н4-Н2А-Н2В/2, тетрамера /НЗ-Н4/2 и димера /Н2А-Н2В/ 40
Реконструкция олигомеров гистонов 41
Обработка трипсином хроматина, олигомеров гистонов и выделение трипсинустойчивой части тетрамера /НЗ-Н4/2, димера /Н2А-Н2В/ и гистона HI 42
Определение молекулярной массы гистонов и их олигомеров методом гель-фильтрации 43
Электрофорез гистонов 44
Спектральные методы анализа 45
Обработка гистонов п-ХМБ 46
Фосфорилирование гистонов протеинкиназой 47
Статистическая обработка результатов 47
ІУ. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 5. СТРУКТУРА И ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГИСТОНОВ НІ 48
ГЛАВА 6. ВЦЦЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА НАТИВНЫХ
ОЛИГОМЕРОВ ГИСТОНОВ: ОКТАМЕРА /НЗ-Н4-Н2А-Н2В/2,
ТЕТРАМЕРА /НЗ-Н4/2 И ДИМЕРА /Н2А-Н2В/ 53
ГЛАВА 7. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ
ОРГАНИЗАЦИИ И СУБФРАКЦИОННОГО СОСТАВА
ОКТАМЕРОВ ГИСТОНОВ /НЗ-Н4-Н2А-Н2В/ ИЗ
СЕМЕННИКОВ И ШЕРМАТОЗОВДОВ КАРПА 57
ГЛАВА 8. ЭТАПЫ СБОРКИ ОКТАМЕРА ГИСТОНОВ В
МОДЕЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ. ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ
СТРУКТУРНЫЕ СОСТОЯНИЯ 65
Реконструкция олигомеров гистонов. Структурные состояния гистонов в 0 - О,І М JfaCI 65
Структурные состояния тетрамера /НЗ-Н4/ и
димера /Н2А-Н2В/ в диапазоне 0,1 - 1,2 М ЛаСІ 74
873. Изменения в структуре тетрамера и димера
при их ассоциации в октамер 82
ГЛАВА 9. СТРУКТУРА ГИСТОНОВ В СОСТАВЕ ХРОМАТИНА
С РАЗЛИЧНЫМ УРОВНЕМ КОМПАКТНОСТИ 87
Стр.
V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 95
VI. ВЫВОДЫ 97
УИ. ЛИТЕРАТУРА 98
Б работе приняты следующие сокращения:
ГАП - гидроксиапатит;
ДНП - дезоксирибонуклеопротеид;
ДС-jla - додецилсульфат натрия;
ЭДТА - этидендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль;
п-ХМБ - пара-хяормеркурибензоат;
трис - гидроксиметил/аминометан/; пАМФ - аденозин-3\5ч|юсфорная кислота.
Введение к работе
Одной из центральных задач в современной биохимии и молекулярной биологии является исследование механизмов регуляции активности генов эукариот. Известно, что целые группы генов могут быть переведены в репрессированное состояние путем конденсации хроматина /НО/. То есть, возможна обратимая репрессия генов на над-нуклеосомном уровне. Различного рода взаимодействия гистонов обеспечивают формирование как нуклеосом, так и наднуклеосомных структур хроматина /1,4, 95, 145, 14/. В связи с этим, анализ пространственной организации и взаимодействий гистонов представляется важным и актуальным. Исследования в этом направлении необходимы для понимания процесса регуляции генетической активности, поиска путей и методов контроля над этим процессом.
В транскрипционно неактивном состоянии хроматин находится в виде конденсированных 30 нм фибрилл. Формирование такой фибриллы из нуклеосом возможно только с участием гистона HI /14, 155, 173, 203, 204/. Предполагают, что это происходит за счет образования полимера гистона HI вдоль фибриллы /204/. Однако в растворе продукты специфической ассоциации гистона HI, а также его трипсинус-тойчивого глобулярного фрагмента не выявляют /177/.
Коровые гистоны, видимо, также принимают участие в конденсации хроматина. Об этом свидетельствует способность октамера гистонов /НЗ-Н4-Н2А-Н2В/2, а также его структурных составляющих -тетрамера /НЗ-Н4/2 и димера /Н2-Н2В/, образовывать высокомолекулярные агрегаты в виде упорядоченных фибрилл /189, 221/. В то же время вопрос о механизмах участия коровых гистонов в этом процессе остается неисследованным. Только для гистона НЗ показано участие в стабилизации наднуклеосомных структур посредством іГ-конце-
вого участка 1-27 /139/.
Переход хроматина в транскршщионно активное состояние сопровождается разрушением наднуклеосомных структур и значительным изменением структуры нуклеосом /95, 223, 224/. При этом происходит изменение пространственной организации октамера гистонов /224/, что, видимо, необходимо для облегчения диссоциации гистонов под воздействием РНК-полимеразы /20/. Логично предполагать, что структура октамеров гистонов в транскршщионно неактивных нуклеосомах способствует их межмолекулярному взаимодействию и стабилизации, таким образом, 30 нм фибриллы. Такого рода отличия в структуре хроматина и октамера гистонов возникают в ходе репликации хроматина при сборке новых нуклеосом /226/. В связи с этим возникает необходимость в детальном анализе процесса сборки октамера гистонов из мономеров.
Удобной моделью для исследования механизмов участия гистонов в инактивации генома является сперматогенез карповых рыб /когда гистоны не замещаются на протамины/. Известно, что при этом происходит увеличение содержания лизин-богатой субфракции гистона HI /12/, что, видимо, влияет на степень компактности хроматина. Однако это практически единственное, что известно в этом плане для гистонов из сперматозоидов'.
В связи с изложенным, основной целью данной работы является исследование в модельных условиях возможных путей участия гистона HI и коровых гистонов в конденсации хроматина и формировании 30 нм фибриллы. Исходя из поставленной цели, в конкретные задачи входило:
Г. Исследовать способность к агрегации гистонов HI.
2. Провести сравнительный анализ структуры октамеров гистонов из семенников и сперматозоидов карпа.
& Исследовать этапы сборки октамера гистонов из мономеров.
4і. Проанализировать структуру и взаимодействия гистонов в составе хроматина с различной степенью компактности.
В результате проведенных экспериментов впервые показана способность гистона НІ в растворе к образованию димеров или высокомолекулярных агрегатов. Показано, что это обусловлено взаимодействием его глобулярных участков. Не выявлено различий в способности к агрегации гистонов НІ и их трипсинустойчивых фрагментов из семенников и сперматозоидов карпа.
Разработан простой и быстрый метод выделения нативных олигоме-ров гистонов - тетрамера /НЗ-Н4/, димера /Н2А-Н2В/, октамера /HS-H4-H2A-H2B/9 и их трипсинустойчивых фрагментов*.
Выявлены отличия в пространственной организации октамеров гистонов из семенников и сперматозоидов карпа, /видимо, при отсутствии отличий в первичной структуре коровых гистонов/.
Показано, что тетрамер и димер могут находиться в трех структурных состояниях, октамер - в двух.
Установлено, что три формы наднуклеосомных структур - компактная и "рыхлая" 30 нм фибрилла, 10 нм фибрилла, могут стабилизироваться коровыми гистонами. При этом существует три уровня доступности гистонов действию трипсина в составе хроматина.
Предполагается, что отличия в структуре октамера гистонов из семенников и сперматозоидов карпа, активных и неактивных нуклеосом возникают в результате структурных перестроек в гистонах /аналогичных выявленным/ в ходе . репликации хроматина при формировании октамера гистонов и нуклеосомы в целом. Такого рода отличия могут влиять на стабильность нуклеосом и наднуклеосомных структур.
Установленные параметры пространственной организации октамера гистонов из сперматозоидов карпа могут быть использованы для тестирования качества сперматозоидов при искусственном разведении рыб.
