Введение к работе
1- .
Актуальность фоны. В связи с расширением сферы применения ферментов в различных областях, таких как пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина, косметология актуальной является проблема поиска новых дешевых источников сырья для их получения, особенно таких, которые являются отходами производств. Благодаря использованию новых современных методов, в том числе сорбционно-хроматографических, в технологии выделения и очистки^в настоящее время стало возможным получение высокоочищенных биологически-активных веществ, в частности ферментов, с высокой удельной активностью, а применение современных аналитических методов исследования, таких как ВЭЖХ, капиллярный и гельэлектрофорез позволило дать обоснованную оценку структуры и качества выделенных веществ.
На протяжении последних лет в СГГХФА на кафедре биотехнологии проводятся исследования фермента гиалуронидазы. Как известно из литературных данных, гиалуронидазы различного происхождения выполняют разные биологические функции и могут отличатся друг от друга по своему строению и свойствам, поэтому изучение этого фермента, полученного из разных источников представляет большой интерес, так как дает возможность проследить эволюционные изменения фермента. Кроме того, получение этого фермента в чистом виде важно для - его практического использования в косметологии, сельском хозяйстве, а также в медицине, в качестве лекарственного препарата «Лидаза». В промышленном масштабе его получают из семенников крупного рогатого скота методом фракционирования органическими растворителями. Технология имеет ряд существенных недостатков, вследствие чего фермент загрязнен примесями и имеет низкую удельную активность. Кроме того, даже дальнейшая тонкая очистка от примесей не приводит к получению гомогенной формы фермента, так как гиалуронидаза из семенников крупного рогатого скота представлена совокупностью полимерных форм с разбросом по молекулярной массе от 10,7 до 200 кДа. Выделение же протомера возможно, но является трудной и дорогостоящей задачей.
В связи с этим, с одной стороны актуальным является, как поиск новых, дешевых альтернативных источников, в которых фермент является протомером, так и разработка сорбционно-хроматографических методов выделения гиалуронидазы, позволяющих получить очищенный фермент с высокой удельной активностью. С другой стороны, актуально проведение сравнительного анализа физико-химических и биологических характеристик ферментов, выделенных из различных источников, который дает возможность выявить особенности в структуре и механизме действия
ферментов стоящих на разных ступенях эволюционного развития и определить область их применения.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлось получение фермента гиалуронидазы из рыбного и микробного сырья, а также проведение сравнительного анализа физико-химических и биологических свойств ферментов, выделенных из источников стоящих на разных ступенях эволюционного развития. Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:
-
Оценить возможность получения гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб и бактерий Pseudomonas Putida (36).
-
Изучить закономерности сорбции гиалуронидазы на ионигах различной структуры, а также подобрать оптимальный сорбент для выделения фермента из многокомпонентной смеси.
3. Разработать на основе полученных данных сорбционно-
хроматографический метод выделения гиалуронидазы из нативного
раствора Pseudomonas Putida (36) и экстракта молок рыб.
4. Изучить свойства выделенных ферментов и дать сравнительную
оценку физико-химических и биологических свойств гиалуронидазы из
молок рыб и гиалуронидазы из бактерий Pseudomonas Putida (36).
Научная новизна. Впервые исследованы в качестве источников гиалуронидазы молоки осетровых и лососевых рыб и бактерии Pseudomonas putida (36). Разработан высокоэффективный сорбционнс— хроматографический метод выделения гиалуронидаз из этих источников, позволяющий получить высокоочищенный фермент с удельной активностью, значительно превышающей удельную активность гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота. Впервые выделен ингибитор микробной гиалуронидазы из нативного раствора Pseudomonas putida (36), исследовано его влияние на кинетику ферментативных реакций и определен тип ингибирования. Впервые проведен сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств гиалуронидаз, выделенных из экстракта молок рыб и нативного раствора Pseudomonas putida (36) с использованием современных методов анализа, таких как ВЭЖХ, капиллярный электрофорез и гельэлектрофорез, позволяющих с высокой степенью точности оценить молекулярную гетерогенность выделенных ферментов. Обнаружены некоторые различия в свойствах ферментов и показан ряд преимуществ гиалуронидазы из молок рыб перед гиалуронидазой из Pseudomonas putida (36) и гиалуронидазой из семенников крупного рогатого скота .
Теоретическая и практическая значимость. В результате работы подобраны новые, перспективные источники сырья для получения гиалуронидазы - молоки осетровых и лососевых рыб и микроорганизм-продуцент - бактерии Pseudomonas putida (36). Изучены закономерности сорбции гиалуронидазы на различных носителях и ,на основе полученных
данных, разработан сорбционно-хроматографический способ выделения данного фермента из таких многокомпонентных смесей как экстракты молок рыб и нативный раствор Pseudomonas putida (36). Изучены физико-химические и биологические характеристики выделенных ферментов, найден ряд общих свойств и различий ^подтверждающих литературные данные о многообразии и неоднородности свойств гиалуронидаз из различных источников. С помощью точных методов анализа произведена сравнительная оценка молекулярной гетерогенности гиалуронидаз из молок осетровых и лососевых рыб, позволяющая сделать предложение о структуре фермента. Выявлены преимущества гиалуронидазы из молок рыб и бактерий Pseudomonas Putida (36) по сравнению с гиалуронидазой из семенников крупного рогатого скота, что позволяет рекомендовать данное сырье для производства фермента в промышленном масштабе.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международном симпозиуме «Проблемы сорбционной детоксикации внутренней среды организма.» (НовосибирскД995), на II Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии (Москва, 1996г.), на Международном симпозиуме «Chromatography in Industry» (Братислава, 1996г.), Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств» (Санкт-Петербург, 1996г.).
Получено решение о выдаче патента на способ получения гиалуронидазы из молок рыб №95102697/13(004857), а сам метод апробирован на заводе медицинских препаратов при АО «Самсон» (Санкт-Петербург) в полупроизводственном масштабе (Акт апробации от 12.02.93,).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 патент.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Молоки осетровых и лососевых рыб, а так же бактерии Pseudomonas
putida (36) могут служить источниками сырья для получения фермента
ГНаЛурОНИДаЗЗ.
-
Сорбционно-хроматографический способ выделения гиалуронидазы из многокомпонентных смесей (экстракт молок рыб, нативный раствор) дает возможность получить фермент с высокой удельной активностью за счет избирательной адсорбции на сульфокатионите и обратимой десорбции.
-
В нативном растворе Pseudomonas putida (36) содержится ингибитор гиалуронидазы, который отделяется от фермента в процессе сорбции-десорбции.
-
Гиалуронидаза из молок рыб и гиалуронвдаза из Pseudomonas putida (36) имеют некоторые различия в физико-химических и биологических свойствах.
5, Гиалуронидаза из молок рыб является протомером и содержит в своем составе углеводную часть, которая оказывает влияние на активность фермента.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследование, экспериментальных данных и их обсуждения, выводов, библиографии. Работа изложена на/У/страницах, содержите таблиц, Г рисунков. Библиография включает №С работ отечественных и зарубежных авторов.
