Введение к работе
Актуальность работы
Проблема восстановления анатомической целостности и функциональности сегментов опорно-двигательного аппарата при его повреждениях по-прежнему остается весьма актуальной. В случае неудачной фиксации, при большом объеме повреждения, а также в пожилом возрасте собственная регенеративная функция кости может оказаться недостаточной, что приводит к неполному сращению, возникновению ложного сустава, повторным переломам или дефектам кости. Для стимуляции репаративного остеогенеза и восстановления целостности костной ткани используются материалы как природного, так и искусственного происхождения [Janicki, 2011].
Применение аутологичного костного материала, полученного из подвздошного гребня, нижней или верхней челюсти самого пациента, высокоэффективно благодаря наличию собственных клеточных и внеклеточных компонентов пациента [Becker, 1994; Urist, 1974], обеспечивающих регенеративный потенциал. Однако процедура забора материала болезненна и травматична, увеличивает время основной операции, может быть связана с последующими осложнениями [Cricchio, 2003; Joshi, 2004], а также имеет ограничения по допустимому объему забираемой костной ткани. Использование аутотрансплататов нежелательно в детском и пожилом возрасте.
В качестве альтернативы аутологичной кости широко применяются материалы на основе деминерализованного костного матрикса (ДКМ) как аллогенного, так и ксеногенного происхождения [Strates, 1993; Савельев, 1996; Solheim, 1998; Bauer, 2000; Oakes, 2003; Takikawa, 2003]. Костный матрикс, лишенный минеральной основы, быстрее васкуляризируется в организме реципиента и замещается новообразованной костной тканью [Urist, 1971; Yoon, 2002; Булатов, 2005]. ДКМ обладает высокой биосовместимостью, может служить матрицей для остеогенных клеток, проникающих в имплантат (остеокондуктивность), а также стимулировать образование новой костной ткани (остеоиндуктивность). По своему составу ДКМ на 98% представляет собой коллаген I типа. Кроме того, ДКМ содержит комплекс костных морфогенетических белков (bone morphogenetic protein, BMP), обуславливающих его остеоиндуктивные свойства.
Согласно результатам современных исследований, BMP являются самыми важными факторами регенерации кости и хряща. BMP это цитокины, принадлежащие к суперсемейству трансформирующего ростового фактора -р. Они действуют на рецепторы клеточной мембраны и играют значительную роль в регулировании роста, дифференцировки и апоптоза различных типов клеток, включая остеобласты, хондробласты, нервные и эпителиальные клетки. К настоящему времени идентифицировано 20 видов BMP, наиболее изученными из которых являются ВМР-2 и ВМР-7.
Активность нативных факторов роста, входящих в состав ДКМ, сильно различается у материалов, полученных по различным методикам [Li, 2000; Wildemann, 2007]. Избыточная деминерализация костного матрикса [Iwata, 2002], использование химических реагентов [Hallfeldt, 1992; Pekkarinen, 2004], термическая обработка [Ни, 1997], высокие дозы гамма-излучения [Howard, 1998], используемые при изготовлении ДКМ, могут существенно снижать активность факторов роста, входящих в его состав, что негативно сказывается на остейндуктивных свойствах материала [Pietrzak, 2009]. Таким образом, существует необходимость разработки методики получения ДКМ с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости, определяющих его остеоиндуктивный потенциал.
Помимо оптимизации условий получения ДКМ, регенеративный потенциал разрабатываемого остеопластического материала может быть повышен за счет введения в его состав дополнительных факторов роста кости. С помощью методов генной инженерии разработаны технологии получения рекомбинантных BMP, в том числе рекомбинантного человеческого ВМР-2 (rhBMP-2) [Niederwanger, 1996; Schwartz, 1998]. Данные технологии позволяют синтезировать белок в количестве, достаточном для производства содержащих его остеопластических материалов в промышленных масштабах [Bessho, 2000].
В настоящее время ряд таких материалов активно применяется в США и странах западной Европы при лечении сложных травм и переломов, например, «INFUSE» (Medtronic Biologies, США) и «OSSIGRAFT» OP-1 (Stryker Biotech, США). Применение этих материалов в России ограничено из-за их крайне высокой стоимости, поэтому разработка остеоиндуктивных костнопластических материалов отечественного производства, более дешевых и доступных, сделает возможным их внедрение в российскую
практику здравоохранения.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы является разработка и оптимизация методики получения композиционного материала с повышенным регенеративным потенциалом на основе костного коллагена (ДКМ) и рекомбинантного белка человека rhBMP-2 для регенерации костной ткани.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработка оптимизированной методики получения высокоочищенного ДКМ с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости.
-
Определение биологической активности in vitro и in vivo препарата rhBMP-2, экспрессированного в клетках Escherichia coli.
-
Разработка методики получения композиционного материала на основе ДКМ с добавлением гиалуроновой кислоты и rhBMP-2, позволяющей сохранить их биологическую активность.
-
Исследование регенеративного потенциала разработанного композиционного материала на моделях дефектов костей животных.
Научная новизна
Разработана оптимальная методика получения высокоочищенного ДКМ в виде крошки, блоков, мембран и стержней различного размера с высоким остаточным содержанием нативных факторов роста кости ВМР-2 (160-180 нг/г) и ВМР-7 (100-145 нг/г), включающая стадии контроля готовой продукции по ряду параметров: степень деминерализации, остаточное содержание липидов, нативных факторов роста ВМР-2 и ВМР-7, влажность, рН, микробиологическая обсемененность.
Доказана высокая биологическая активность полученного в лаборатории препарата rhBMP-2, экспрессированного в клетках Escherichia coli. Полученный препарат взаимодействует со специфическими антителами к ВМР-2. Остеоиндуктивная активность rhBMP-2 в тестах in vitro и in vivo не уступает активности зарубежных коммерческих препаратов-аналогов.
Разработана методика иммобилизации rhBMP-2 на ДКМ, позволяющая сохранить их биологическую активность. Для повышения пластичности полученного композиционного материала на основе ДКМ в его состав была добавлена гиалуроновая кислота, было подобрано оптимальное соотношение компонентов.
Показан высокий регенеративный потенциал разработанных
остеопластических материалов на моделях ортотопического остеогенеза у
крыс, восстановления сегментарного дефекта гребня альвеолярного отростка челюсти собаки, а также дефектов бедренных и болыиеберцовых костей у кроликов.
Проведены токсикологическое исследование, а также клиническая апробация разработанных материалов.
Практическая значимость работы
Разработанный в рамках диссертационной работы материал на основе ДКМ в виде крошки был зарегистрирован как ИМН «Крошка костная деминерализованная лиофилизированная для заполнения костных дефектов «Гамалант-крошка»» (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13111) и разрешен для применения на территории Российской Федерации в качестве изделия медицинского назначения. Область применения: травматология, ортопедия, спинальная хирургия, челюстно-лицевая хирургия.
Остеопластические материалы на основе ДКМ в виде блоков, мембран и стержней с добавлением рекомбинантного фактора роста кости rhBMP-2, полученные по разработанной технологии, могут быть использованы в качестве изделий медицинского назначения и в качестве компонентов при изготовлении других изделий медицинского назначения, применяемых в общей травматологии, хирургии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и стоматологии.
Препарат rhBMP-2, полученный по разработанной методике, может применяться как дополнительный компонент различных композиционных остеопластических материалов с целью улучшения их остеоиндуктивных свойств.
Апробация работы
Результаты работы доложены на IX всероссийском съезде травматологов-ортопедов в г. Саратов 15-17 сентября 2010 года, всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Илизаровские чтения» в г. Курган 8-10 июня 2011 г., всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» в г. Москва 14-15 октября 2011 г., научно-практической конференции с международным участием «Чаклинские чтения» в г. Екатеринбург 26-27 октября 2011 г., международной научно-практической конференции «Фармацевтические и Медицинские Биотехнологии» в г. Москва 20 - 22 марта 2012 г., всероссийской научно-практической конференции «Малоинвазивные технологии в
травматологии - ортопедии и нейрохирургии» в г. Саратове 26-27 сентября
2013 г., XVI съезде ортопедов-травматологов Украины в г. Харьков 3-5 октября 2013 г.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 - в журналах, в том числе в трех, рекомендованных ВАК РФ; 6 - в материалах конференции; получен один патент на изобретение.
Структура и объем работы
