Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4-5
ГЛАВА I. ПРИРОДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ФЕРМШТОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 6-19
Ингибиторы протеиназ из грибов 11-16
Ингибиторы нуклеаз грибов 16-18
Белковые ингибиторы ферментов липидного обмена.. 18-19
ГЛАВА 2. ОБЩИЕ СВВДЕНИЯ О ЛШОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТАХ
ГРИБОВ 20-34
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ 35-47
3.1. Культивирование гриба 35
3.2.- Препарат липазы из гомогената мицелия 35-36
Определение липазной активности 36-37
Определение ингибиторной активности 37-38
Определение белка 38
Аналитический диск-электрофорез на ПААГе 38-39
Препаративный диск-электрофорез на ПААГе 39
Энзимограмма липаз на ПААГе 40
Обработка ингибиторным белком гелевых столбиков
с липазной активностью после электрофореза 40
Очистка ингибитора липазы 41-42
Определение молекулярной массы 42
Определение аминокислотного состав ингибитора... 42-43
Определение N -концевой аминокислоты ингаби-торного белка 43-44
Определение С -концевой аминокислоты 44-45
Методика получения поликефамида 45-47
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 4. ОШАРУЖШИЕ ИНГИБИТОРА ЛИПАЗЫ В КУЛЬТУРЕ
RHIZOPUS MICROSPORUS 48-61
ГЛАВА 5. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ИНГИШТОРА ЛИПАЗЫ ИЗ НАД-
ОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ ГОМОГШАТА МИЦЕЛИЯ ГРИБА 62-82
5.1. Получение препарата ингибитора .. 62-70
5 «2 Свойства ингибитора липазы 70
Определение молекулярной массы ингибитора 70-74
Определение N- и С-концевых аминокислот ингибитора 74
5.5; Субъединичная структура ингибитора липазы 74-82
ГЛАВА 6. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ ЛИПАЗ ИЗ
ГРИБА RHIZOPUS MICROSPORUS И ИЗУЧЕНИЕ ИХ
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ИНГИБИТОРОМ 83-101
Получение частично очищенных комплексных препаратов внеклеточных липаз 83-87
Очистка внеклеточных и внутриклеточных липаз
гриба Rhizopus microsporus 87-S4
6.3; Изучение взаимодействия ингибитора с различными
формами липазы гриба Rhizopus microsporus .... 94-101
ВЫВОДЫ I0I-I02
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 103-123
Введение к работе
Исследование регуляции биосинтеза ферментов является одним из основных направлений современной биологии. Среди множественных факторов, регулирующих активность ферментов, особое место занимают ингибиторы белковой природы. По современным представлениям, белковые ингибиторы являются компонентами системы оперативного контроля активности ферментов в клетке; Их действие осуществляется без потери фермента и ингибитора7; В настоящее время из микроорганизмов различных таксономических групп выделены и охарактеризованы специфические ингибиторы ряда ферментов: протеазг, амилаз", ферментов нуклеинового обмена', хитинсинтетазы, АТФазы, фосфолипазы; лизоцима и т;д; Для некоторых из них разработаны способы их иммобилизации, получены биоспецифические сорбенты на их основе. Они используются для изучения белок-белкового взаимодействия, сопровождающегося конформационными изменениями белков без нарушения их первичной структуры,
В то же время не для всех ферментов выделены их природные ингибиторы; Прежде всего это относится к липазам (КЖ-З.ііі.З). В связи с тем, что внутриклеточные липазы участвуют в метаболизме липидов, являющихся компонентами различных внутриклеточных структур, можно ожидать, что клетки контролируют активность этих ферментов и с помощью белковых ингибиторов;' Поэтому поиск природных ингибиторов липаз среди внутриклеточных белков микроорганизмов является актуальным. В последние годы в институте микробиологии АН УзССР описаны ряд продуцентов липаз, среди которых - Rhizopus microsporus, отличается как высокой продуктивностью, так и содержанием мно-
жественности молекулярных форм. При изучении липаз этого гриба нами было обнаружено вещество белковой природы, при взаимодействии которого с различными формами липаз этого же продуцента активность последных понижалась.
Целью настоящей работы было получение и изучение ингибитора липазы из гриба Rhizopus microsporus. В связи с этими основными задачами исследования были:
Поиск ингибитора в гомогенате мицелия;
разработка способа выделения и очистки ингибитора липазы;
изучение некоторых физико-химических свойств ингибитора;
выделение и очистка различных форм липаз и изучение взаимодействия ингибитора с ними.
Поскольку в литературе до настоящего времени отсутствуют данные об ингибиторах липаз, первую часть обзора литературы мы посвящали природным ингибиторам ферментов вообще. Вторая часть обзора литературы посвящена липолитическим ферментам, где преимущественно освещены вопросы выделения, очистки и функциональные свойства липаз грибов.
