Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
1.1. Биокатализаторы на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов 11
1.1.1. Иммобилизованные клетки в биотехнологии 11
1.1.2. Методы иммобилизации мицелиальных грибов 12
1.1.3. Общая характеристика криогеля поливинилового спирта как носителя для иммобилизации клеток 14
1.1.4. Свойства иммобилизованных клеток 18
1.2. Молочная кислота 22
1.2.1. Практическое значение молочной кислоты и ее производных 22
1.2.2. Химические методы получения молочной кислоты 25
1.2.3. Микробиологические способы получение молочной кислоты 26
1.2.3.1. Бактериальные продуценты молочной кислоты 26
1.2.3.2. Мицелиальные грибы - продуценты молочной кислоты 31
1.2.3.3. Биокатализаторы на основе иммобилизованных грибов -продуцентов молочной кислоты 37
1.3. Липолитические ферменты 42
1.3.1. Общая характеристика липолитических ферментов 43
1.3.2. Влияние различных факторов на биосинтез липаз мицелиальных грибов 51
1.3.3. Иммобилизованные грибные продуценты липолитических ферментов 53
1.3.4. Проблемы очистки сточных вод, содержащих вещества липидной природы 57
Глава II. Материалы и методы исследования 62
2.1. Материалы 62
2.1.1. Химические реактивы 62
2.1.2. Микроорганизмы 63
2.2. Методы 63
2.2.1. Хранение культур грибов 63
2.2.2. Выращивание и хранение культур бактерий 63
2.2.3. Иммобилизация спорового материала и биомассы бактерий в криогель ПВС 64
2.2.4. Сбраживание глюкозосодержащей среды свободными и иммобилизованными клетками бактерий в периодическом реакторе 65
2.2.5. Культивирование клеток гриба R. oryzae
в процессах получения молочной кислоты 66
2.2.6. Определение амилазной активности 68
2.2.7. Определение концентрации глюкозы 69
2.2.8. Определение динамической вязкости растворов по методу Оствальда 70
2.2.9. Определение концентрации молочной кислоты 70
2.2.10. Определение концентрации крахмала 71
2.2.11. Определение сухого веса биомассы 72
2.2.12. Определение концентрации внутриклеточного АТР биолюминисцентным методом 72
2.2.13. Культивирование клеток гриба R. oryzae
в процессах биосинтеза внеклеточных липолитических ферментов 73
2.2.14. Определение активности липазы модифицированным методом Олфорда и Пирса 75
2.2.15. Определение ХПК 76
2.2.16. Хроматографическое разделение комплекса липолитических ферментов, секретируемых свободными и иммобилизованными клетками гриба R. oryzae 77
2.2.17. Электронная и световая микроскопия образцов гранул 78
2.2.18. Электрофоретический анализ белков 78
2.2.19. Исследование реологических характеристик гранул, полученных на основе криогеля поливинилового спирта 78
2.2.20. Определение кинетических параметров процессов с использованием свободных и иммобилизованных клеток 79
Глава III. Результаты и обсуждение 84
3.1. Биокатализатор для получения молочной кислоты: условия формирования и свойства 84
3.1.1. Скрининг культур по соотношению синтезируемых ими L- и D-изомеров молочной кислоты 84
3.1.2. Получение молочной кислоты при использовании свободных и иммобилизованных клеток бактерий ; 86
3.1.2.1. Кинетические характеристики сбраживания глюкозы свободными бактериальными клетками 86
3.1.2.2. Молочнокислое брожение в реакторе периодического действия с использованием концентрированных суспензий клеток L. casei 88
3.1.2.3. Молочнокислое брожение в реакторе периодического действия с использованием иммобилизованных клеток бактерий L. casei 90
3.1.3. Получение молочной кислоты при использовании свободных и иммобилизованных клеток гриба R. oryzae 92
3.1.3.1. Продуцирование молочной кислоты свободными клетками R. oryzae 92
3.1.3.2. Получение молочной кислоты иммобилизованными клетками R. oryzae в процессе формирования биокатализатора при использовании питательных сред различного состава 94
3.1.3.2.1. Формирование биокатализатора при использовании питательной среды с глюкозой 94
3.1.3.2.2. Формирование биокатализатора при использовании крахмалосодержащей питательной среды 98
3.1.3.2.3. Сравнительный анализ процессов формирования биокатализатора на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae, выбор оптимальных условий 100
3.1.3.3. Получение молочной кислоты при использовании биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae 103
3.1.3.3.1. Получение молочной кислоты в периодическом процессе с использованием питательной среды, содержащей глюкозу 104
3.1.3.3.2. Накопление молочной кислоты в режиме периодического процесса с подпитками субстратом — глюкозой 108
3.1.3.3.3. Получение молочной кислоты в периодическом процессе при использовании кислотных гидролизатов крахмала 110
3.1.3.3.4. Получение молочной кислоты при использовании кислотных гидролизатов крахмала в периодическом процессе с подпитками субстратом 112
3.1.3.3.5. Получение молочной кислоты в периодическом процессе при использовании клейстеризованного крахмала 114
3.1.4. Анализ параметров процесса получения молочной кислоты с использованием биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae 118
3.2. Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae, секретирующих липолитические ферменты 124
3.2.1. Скрининг продуцентов липаз среди штаммов гриба Rhizopus oryzae для разработки биокатализатора на основе иммобилизованных клеток 124
3.2.2. Влияние состава питательной среды на формирование свободного и иммобилизованного мицелия, секретирующего липазы 126
3.2.3. Влияние различных факторов на результаты многократного использования
иммобилизованных клеток гриба R. oryzae, продуцирующих липазы 134
3.2.3.1. Влияние состава среды на липолитическую активность внеклеточных ферментов, секретируемых иммобилизованными клетками гриба 134
3.2.3.2. Характеристики биокатализатора на основе клеток гриба иммобилизованных в криогеле ПВС R. oryzae, осуществляющих биосинтез внеклеточных липолитических ферментов 142
3.2.4. Анализ комплексов липолитических ферментов, секретируемых свободными и иммобилизованными клетками гриба R. oryzae 144
3.2.5. Исследование возможности использования биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae для очистки сточных вод, содержащих вещества липидной природы 149
Заключение 153
Выводы 155
Список литературы
- Общая характеристика криогеля поливинилового спирта как носителя для иммобилизации клеток
- Иммобилизация спорового материала и биомассы бактерий в криогель ПВС
- Скрининг культур по соотношению синтезируемых ими L- и D-изомеров молочной кислоты
- Получение молочной кислоты при использовании биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae
Введение к работе
В настоящее время при использовании биокаталитических систем на основе микроорганизмов эффективно решаются задачи, связанные с экологически безопасным получением различных веществ и утилизацией сложных по составу отходов ряда производств. Для решения проблем, связанных с сокращением длительности таких процессов и увеличением их эффективности, необходима разработка новых биокаталитических систем при использовании перспективных продуцентов и альтернативных подходов, например, иммобилизации клеток.
Иммобилизация микроорганизмов при создании биокатализаторов (БК) благодаря повышению резистентности клеток к воздействию различных факторов часто обеспечивает увеличение периода полуинактивации БК, при этом становятся возможными многократное использование биомассы и сокращение ряда технологических операций, связанных с необходимостью отделения биомассы клеток от культуральной жидкости.
Криогель поливинилового спирта (ПВС) обладает макропористой структурой, а также высокими прочностными и массообменными характеристиками, химически стабилен, пригоден для реутилизации, и поэтому его использование целесообразно при создании новых высокоэффективных БК на основе иммобилизованных клеток.
Известно, что особенности физиологии микроскопических грибов свидетельствуют о положительном эффекте присутствия иммобилизующей матрицы на формирование мицелия. Для получения БК на основе грибных продуцентов возможно использование спорового материала, при этом негативное влияние самой иммобилизации на клетки минимально что, несомненно, является привлекательным с точки зрения получения эффективных биокаталитических систем. Для формирования готового БК гранулы с иммобилизованными спорами проводят через стадию культивирования с целью получения иммобилизованного активного мицелия.
Исследование влияния иммобилизации на характеристики иммобилизованных в криогель ПВС клеток мицелиальных грибов представляет большой научный интерес, так как ранее систематические исследования в этом направлении не проводились. К тому же, мицелиальные грибы являются перспективными продуцентами ряда метаболитов, не требуют сложных питательных сред для культивирования, проявляют повышенную устойчивость к негативному влиянию различных факторов (низкие значения рН, высокие концентрации метаболитов и др.) и поэтому являются интереснейшим объектом исследования при разработке биокаталитических систем, в том числе для получения молочной кислоты (МК) и внеклеточных липолитических ферментов. Так при
использовании грибов рода Rhizopus возможно получение оптически чистой МК (97-99% L-формы). Мицелиальные грибы способны секретировать комплексы липолитических ферментов с широкой субстратной специфичностью.
В настоящее время мировая потребность в МК составляет около 400 тыс. т/год. Известно, что спрос на МК ежегодно растет в связи с расширением областей применения этого продукта в различных областях (в консервной, мясоперерабатывающей, рыбной, молокоперерабатывающей, масложировой и других отраслях пищевой промышленности, а также в текстильной, кожевенной, парфюмерно-косметической промышленности). Биодеградируемые (разлагаемые микроорганизмами) полимеры на основе солей полимолочной кислоты представляют собой многообещающую альтернативу традиционно используемым упаковочным материалам (к 2008 г. планируется производить до 140 тыс. т подобных полимеров ежегодно). Получение относительно чистых растворов МК при низкой себестоимости позволит реализовать ее применение в качестве источника семейства новых полимеров, которые способны вытеснить многие из ныне используемых, прежде всего благодаря подверженности био- и фотодеградации, высокой прочности, термопластичности, совместимости с природной средой и возможности их выработки из возобновляемого сырья.
Отрасли отечественной промышленности испытывают дефицит в МК, 80% этого продукта в Россию импортируется. В настоящее время на практике для биосинтеза МК используют только клетки бактерий. Для интенсификации существующего производства необходим переход к новым продуцентам, видам сырья и процессам с существенно сниженной экологической нагрузкой. В связи с этим, актуальной представляется разработка новых эффективных подходов к процессу получения МК, в частности, создание и использование биокаталитических систем на основе иммобилизованных клеток мицелиальных грибов.
Липолитические ферменты, как и МК, востребованы на современном рынке, в частности, в пищевой, легкой и кожевенной промышленности, в медицине, в сельском и коммунальном хозяйстве. Ежегодно в мире производится и реализуется около 1 тыс. т коммерческих препаратов липаз. Растущий в последние годы интерес исследователей к липолитическим ферментам с разной субстратной специфичностью делает актуальной разработку новых биокаталитических систем на основе иммобилизованных грибных продуцентов внеклеточных ферментов, катализирующих конверсию сложных по составу липидосодержащих субстратов. Очевидно, что подобные системы могут оказаться эффективными при очистке жиросодержащих сточных вод различных производств.
Таким образом, разработка и исследование кинетических характеристик БК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток грибов являются актуальными, так как направлены на то, чтобы заполнить ниши фундаментальных знаний о свойствах иммобилизованных клеток, а также спрогнозировать условия наиболее эффективного режима получения такого рода систем и проведения различных биокаталитических процессов с их участием.
Общая характеристика криогеля поливинилового спирта как носителя для иммобилизации клеток
Известно, что в обычных гомогенных гелевых системах (полиакриламидных, каррагинановых, альгинатных) условия, необходимые для нормального развития биомассы, соблюдаются лишь в приповерхностных областях матрицы носителя. Наличие пор малого диаметра приводит к тому, что снабжение иммобилизованных клеток субстратами и отвод метаболитов внутри массы геля существенно затруднены вследствие диффузионных ограничений, что приводит к угнетению и отмиранию иммобилизованных клеток во внутренней части БК [10, 27-29]. Этого можно избежать путем использования макропористых ячеистых матриц, в которых диффузия веществ к клеткам и от них в фазе геля не затруднена. Именно такой структурой обладают криогели поливинилового спирта (ПВС) - гетеропористые вязкоупругие гидрогели.
Высокопористые гели, получаемые методом замораживания - оттаивания концентрированных водных растворов ПВС, используют в качестве носителей для иммобилизации клеток микроорганизмов [15,29-30].
При формировании структуры криогеля происходит кристаллизация растворителя (воды) и сегрегация фаз, а кристаллы растворителя выступают в роли порообразователя [31-34]. Важной характеристикой криогеля ПВС является его гетерогенная высокопористая структура, возникающая в результате протекания гелеобразования в двухфазной среде, которая состоит из поликристаллов льда и жидкой микрофазы (Рис. 1).
Так как лед в основном объеме системы служит порообразователем, то после его плавления в структуре криогеля ПВС образуются крупные поры микронных размеров различной «архитектуры». Такой механизм гелеобразования определяет макропористый характер структуры криогеля ПВС, которая была изучена с помощью различных видов электронной микроскопии [15, 35].
Одним из несомненных достоинств носителей на основе криогелей ПВС являются их физико-механические характеристики, в частности, нехрупкая вязкоупругая матрица практически не подвергается абразивному износу даже при интенсивном перемешивании. Такие характеристики достигаются комбинацией упругих и пластических свойств: модуль упругости может достигать значения 20-30 кПа без появления хрупкости [36-37], которая, в общем, присуща большинству альгинатных, каррагинановых и агаровых носителей. Реологические характеристики криогеля ПВС напрямую связаны с его термическими показателями. Показано [38-39], что чем выше прочность криогеля ПВС, тем выше его температура плавления (криогели ПВС - это нековалентные термообратимые гели, поэтому при нагревании они плавятся, а при последующей криогенной обработке вновь образуется криогель). Термостабильность криогеля ПВС такова (температура плавления превышает 70-80 С), что в его матрицу, наряду с мезофильными, можно иммобилизовать и термофильные культуры.
ПВС - дешевый синтетический полимер, мировое производство которого составляет несколько сотен тысяч тонн в год. Каждая марка строго стандартизована. Полимер химически стабилен, нетоксичен и устойчив к бактериальному заражению. Криогели ПВС механически прочны при рН от 2,0 до 10,0 [40].
Физико-химические свойства криогелей ПВС и их пористость определяются характеристиками используемого полимера (молекулярная масса, количество блокированных ОН-групп), его концентрацией в исходном растворе и режимами криогенной обработки (температура и продолжительность замораживания, скорость оттаивания, наличие добавок и т.д.) [41].
Благодаря наличию гидроксильной группы у каждого второго углеродного атома своей цепи ПВС в растворах за счет образования водородных связей склонен к ассоциации, быстро проявляющейся при изменении термодинамического состояния растворителя (например, при охлаждении) [10]. Основным типом межмолекулярных контактов в образовании узлов трехмерной сетки в этих гелях являются водородные связи между ОН-группами соседних межмолекулярные водородные связи синдиотактических участков ПВС (Рис. 2а), фрагментов задействованы в формировании по цепи (Рис. 26). полимерных цепей. Считается, что в основном образуются гидроксилами тогда как спиртовые группы изотактических водородных связей с ближайшими соседями а) водородные связи в синдиотактических участках цепей Рис. 2. Образование множественных меж-при формировании криогеля ПВС. б) водородные связи в изотактических участках цепей и внутримолекулярных водородных связей
Методика включения клеток в матрицу криогеля ПВС достаточно проста (Рис. 3). Биомассу суспендируют в растворе ПВС, полученную композицию замораживают при определенных условиях и затем выдерживают при +4С до полного оттаивания. Описаны модификации этой схемы, предусматривающие, например, частичную лиофилизацию замороженного образца или многократное "замораживание - оттаивание" [15].
Иммобилизация спорового материала и биомассы бактерий в криогель ПВС
В работе использовались следующие реактивы: натрий углекислый однозамещенный, х.ч. (Химмед), реагент для определения концентрации лактата (Lactate Dry-Fast, Sentinel, Италия), натрий углекислый безводный, х.ч. (Химмед), крахмал (картофельный "высший сорт", Белынический крахмальный завод, Беларусь, ГОСТ 7699-78), сульфат магния 7-водный, х.ч. (Химмед); хлорид магния 6-водный, х.ч. (Химмед); калий фосфорнокислый двузамещенный, ч.д.а. (Химмед); калий фосфорнокислый одназамещенный, ч.д.а. (Химмед); триптон (Serva, США); агар (Difco, США); глюкоза, ч. (Химмед); мясо-пептонный экстракт (Россия); Tween-80 (Merck, Германия); концентрированная серная кислота, х.ч. (Химмед); гидроксид калия, х.ч. (Химмед); поливиниловый спирт, марки 16/1, (НПО "Азот", Украина); карбонат кальция, ч. (Химмед); концентрированная соляная кислота о.с.ч. (Химмед); концентрированная уксусная кислота, о.с.ч. (Реахим); ацетат натрия 3-водный, о.с.ч. 2-4 (Химмед); цитрат натрия двузамещенный 5-водный, о.с.ч. (Химмед); йодид калия, х.ч. (Химмед); йод металлический, х.ч. (Реахим); арсенат натрия, х.ч. (Химмед); гидроксид натрия, х.ч. (Реахим); хлорид кальция, ч. (Химмед); сульфат цинка 7-водный, х.ч. (Химмед); натрий хлористый, ч. (Химмед); сульфат серебра, х.ч. (Химмед); сульфат кальция, х.ч. (Химмед); спирт этиловый, (Химмед); хлорид трехвалентного железа 6-водный, ч. (Химмед); сульфат ртути, х.ч. (Химмед); бихромат калия, ч. (Химмед); сульфат аммония, ч. (Химмед); хлорид аммония, ч.д.а. (Химмед); гидролизат казеина (Merck, Германия); экстракт кукурузной кочерыжки (Serva, США); димексид (Р 75.244.9., ЗАО Розфарм); реагент для определения концентрации АТФ Иммолюм (ООО Люмтек, Россия); петролейный эфир (Химмед); фенолфталеин (Химмед); дрожжевой экстракт (OXOID, Великобритания); лецитин (ТУ 9746-011-01897373-02, ГУНИИ Биомедицинской химии РАМН); сметана (ТУ-9222-001-50179010-00, ООО Ростагрокомплекс); майонез (ТУ-9143-005-00333517-98, ООО Юнилевер СНГ); свиной жир (ТУ-9213-002-473468000-99, ООО МДБ); масло сливочное ( ГОСТ-3791, ЗАО Европродукт); маргарин (ТУ-9142-009-00336444-2001, Нижегородский МЖК); говяжий жир (ГОСТ-5284-84, Главпродукт); масло оливковое (Jose Morales СЕ ESP: 104 R. G. S. N. 1602217/V, Испания); масло растительное (ГОСТ 88064000); масло кукурузное (ГОСТ 88082000); масло подсолнечное (ГОСТ 350210012).
При проведении скрининга эффективных продуцентов МК и липолитических ферментов в работе были использованы штаммы аэробных грибов Rhizopus oryzae, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Aspergillus foetidus, а также несколько штаммов грам-положительных бесспоровых, палочковидных молочнокислых бактерий родов Lactobacillus и Streptococcus. Все культуры микроорганизмов были получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) и Всероссийской Коллекции Микроорганизмов (ВКМ).
Очищенный картофель (200 г) варили віл дистиллированной воды в течение 40 мин. Затем картофельный отвар процеживали, охлаждали до комнатной температуры и вносили в питательную среду следующего состава (г/л): глюкоза - 20, MgSC 4 - 0,2, СаСО3-0,2,агар-20.
Для накопления спорового материала грибную культуру высевали на чашки Петри и матрацы с агаризованной средой. Чашки Петри и матрацы с посеянной культурой инкубировали в термостате при 28С в течение 3-4 сут. После споруляции грибную культуру на чашках Петри и матрацах хранили при 4С.
Выращивание и хранение культур бактерий Все культуры бактерий поддерживали на питательной среде (твердая агаризованная среда MRS), следующего состава (г/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, мясо-пептонный экстракт - 10, глюкоза - 23, ацетат натрия - 5, цитрат натрия двузамещенныйх5Н20 - 3, К2НР04хЗН20 - 2,5, MgS04x7H20 - 0,2, MnS04xH20 - 0,04, Твин 20-1, агар - 20 (рН 6,5 - 6,9).
Для накопления бактериальной биомассы для всех культур в работе использовали жидкую питательную среду MRS того же состава, но без агара.
Хранили все культуры при 4С и пересевали 1 раз в месяц. Для получения инокулятов производили посев культур петлей с чашек Петри в 20 мл стерильной среды MRS. Для получения необходимого количества биомассы: 20 мл 9-11 часового инокулята вносили в 200 мл стерильной питательной среды MRS. Рост всех клеток осуществлялся при 37С в аэробных условиях при постоянном перемешивании (200 об/мин). При выращивании клеток разных штаммов пробы отбирали каждые 30-60 мин. За ростом биомассы бактериальных клеток следили спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при длине волны 540 нм (спектрофотометр Agilent UV-853, Германия), а точную концентрацию клеток определяли по калибровочным графикам. Пробы культуральной жидкости периодически отбирали, центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин для отделения биомассы клеток, в супернатанте определяли концентрацию МК и глюкозы.
После достижения оптической плотности клеток - 4,5-5,5 биомассу каждой культуры отделяли центрифугированием и далее использовали для проведения молочнокислого брожения в периодическом реакторе и иммобилизации в криогель ПВС.
Иммобилизация спорового материала и биомассы бактерий в криогель ПВС Процесс иммобилизации спор и клеток бактерий состоял из следующих этапов: - приготовление раствора ПВС; - приготовление суспензии спор или клеток бактерий в растворе ПВС; - замораживание суспензии спор или клеток в растворе ПВС; - выдерживание ее в замороженном состоянии; - размораживание системы.
На основе 2% раствора дрожжевого экстракта приготовили 10% раствор ПВС, который далее стерилизовали в автоклаве (0,5 ати, 10 мин).
Грибные споры смывали с матраца стерильным 0,9% раствором хлорида натрия и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 540 нм (спектрофотометр Agilent UV-853, Германия) для определения концентрации спор по калибровочному графику. Полученную суспензию спор с концентрацией 4x106 спор/мл смешивали с 10% раствором ПВС до получения однородной массы.
Выращенные клетки бактерий центрифугировали (30 мин, 5000 об/мин, центрифуга "Beckman 2-21", США), промывали свежей питательной средой и снова центрифугировали (10 мин, 5000 об/мин) для получения плотного осадка. Клетки смешивали с раствором ПВС до получения гомогенной 10% суспензии клеток в 10% растворе ПВС.
Скрининг культур по соотношению синтезируемых ими L- и D-изомеров молочной кислоты
Был проведен скрининг продуцентов МК среди молочнокислых бактерий и мицелиальных грибов. Все штаммы микроорганизмов, согласно данным, предоставленным Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), были способны при определенных условиях (клетки бактерий при 37-45С, а клетки грибов при 28-30С) к продуцированию МК в концентрации не менее 10 г/л, что, собственно, рассматривается в мировой практике, как признак потенциального промышленного продуцента МК.
В ходе скрининга все клетки в равных исходных концентрациях помещали в питательную среду одного и того же состава, содержащую 23 г/л глюкозы, культивирование проводили в течение 48 ч. В виду того, что соотношение D(-)- и Ц+)-форм МК в конечном продукте ферментации имеет, как уже отмечалось выше, большое значение, все культуральные жидкости, полученные в результате культивирования отобранных для исследования штаммов микроорганизмов, были проанализированы не только по общему содержанию МК, но и по соотношению изомеров МК в конечном продукте (Табл. 15).
Согласно полученным результатам, все культуры характеризовались разной продуктивностью и соотношением D(-)- и Ц+)-изомеров МК в конечном продукте.
Среди близкородственных штаммов микроорганизмов, принадлежащих к одному роду и виду Lactobacillus casei, были штаммы, способные синтезировать не более 5% D-изомера наряду с теми, в продуктах брожения которых этот изомер составлял половину всей накопленной МК. В результате скрининга для дальнейших исследований бьши отобраны два бактериальных штамма: L. casei В-7608 и L. casei В-8101.
Из всего ряда исследованных культур (как бактериальных, так и грибных), совершенно очевидно, выделялся штамм гриба Rhizopus oryzae F-814, проявивший свои способности к высокой продуктивности по МК преимущественно Ц+)-формы. Именно он далее бьш использован в исследованиях, связанных с разработкой БК на основе клеток гриба, иммобилизованных в криогель ЛВС.
Было выдвинуто предположение о возможности интенсификации процесса сбраживания глюкозы до МК в анаэробных условиях за счет использования в реакторе высоких концентраций свободных клеток, выращенных предварительно в аэробных условиях на полноценной питательной среде и характеризующихся максимальной удельной скоростью роста и продуктивностью по МК. Применение высоких концентраций клеток могло привести к увеличению выхода конечного продукта, снижению удельной скорости роста клеток, и, следовательно, минимизации расхода потребляемого субстрата на прирост биомассы. Эти же клетки было решено использовать для иммобилизации. Поэтому среди отобранных штаммов бактерий нужно было выбрать штамм, характеризующийся максимальной удельной скоростью роста и показателями продуктивности по МК.
При исследовании кривых роста бактериальных клеток 2-х отобранных штаммов и их анализе (Рис. 19, 20) было установлено, что для клеток бактерий,, относящихся к одному и тому же роду и виду характерны разные удельные скорости роста в аэробных условиях, уровни накопления биомассы и, соответственно, уровни продуктивности по МК (Табл. 16, 17).
После сравнения кинетических параметров роста 2-х культур, а именно: удельных скоростей роста, концентраций накапливаемой биомассы, скоростей накопления и выходов МК (Табл. 16, 17), был сделан вывод о том, что штамм L. casei В-8101 обладает наилучшими показателями для эффективного накопления продуктивной биомассы в аэробных условиях и последующего ее использования в процессе конверсии субстрата в МК.
Далее клетки L. casei В-8101 концентрировали (центрифугированием) в конце экспоненциальной фазы роста (после 14 ч культивирования), когда накапливалось максимальное количество продуктивной биомассы и использовали их для проведения исследований процесса молочнокислого брожения, осуществляемого концентрированными суспензиями свободных клеток молочнокислых бактерий и для получения БК на основе иммобилизованных клеток.
Как было отмечено в литературном обзоре, для повышения показателей продуктивности процесса можно использовать биомассу свободных клеток в сконцентрированном виде или иммобилизованные клетки. Оба подхода направлены на повышение коэффициента конверсии субстрата в конечный продукт. Однако, для различных систем эффективность каждого подхода неодинакова, поэтому ее оценивают только на основании результатов практических экспериментов.
С целью исследования возможности увеличения продуктивности процесса накопления продукта и степени конверсии субстрата в МК, была исследована способность клеток L. casei В-8101 продуцировать МК в отсутствие заметного роста культуры при высоких концентрациях биомассы.
Биомасса, отмытая с помощью фосфатного буфера (рН 6,5) от остатков среды выращивания, была получена в виде осадка (влажность 85%) после центрифугирования культуральной жидкости, ресуспендирована в среде сбраживания до определенной концентрации клеток и перенесена в термостатируемый реактор (37С) с постоянным перемешиванием (200 об/мин). В реакторе поддерживали анаэробные условия. Для проведения исследований по молочнокислому сбраживанию глюкозы (исходная концентрация 100 г/л) были приготовлены суспензии с пятью разными концентрациями клеток (Рис. 21).
Отсутствие роста клеток было подтверждено спектрофотометрически при контроле численности клеток в составе концентрированных клеточных суспензий, а также методом высева на чашки Петри последовательных разведений с последующим подсчетом колоний-образующих единиц. С помощью последнего метода следили также за наличием посторонней микрофлоры в реакторе.
Получение молочной кислоты при использовании биокатализатора на основе иммобилизованных клеток гриба R. oryzae
Согласно полученным результатам, при исходной концентрации глюкозы 120 г/л, максимальная концентрация накапливаемой за 40 ч в среде МК составила 85 г/л, что соответствовало 70%-ному выходу продукта (Рис. 24). Проведение аналогичного эксперимента со свободными клетками гриба в течение 120 ч без замены питательной среды позволяло получать продукт с более высокой концентрацией - 90 г/л (выход - 75%), но, при этом средняя продуктивность процесса была на 30% ниже. На 120-ом ч культивирования в режиме с заменой питательной среды было отмечено максимальное накопление биомассы в реакторе - до 8,8 г/л (Рис. 24).
Анализ полной кинетической кривой роста гриба R. oryzae был проведен с использованием уравнений 9-36 п.2.2.20., полученные результаты представлены в Табл. 22.
Сравнивая полученные результаты с литературными данными (Табл. 5), можно сделать вывод о том, что выбранный штамм R. oryzae, действительно является одним из наиболее перспективных для получения L(+)-MK. Для создания более технологичных условий получения МК было проведено исследование, направленное на разработку БК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток гриба R. oryzae. Криогель ПВС, как отмечалось ранее, обладает как носитель для иммобилизованных клеток рядом уникальных характеристик и поэтому, как ожидалось, должен был создать благоприятные условия для массообменных процессов при получении МК в аэробных условиях.
Для получения L(+)-MK был разработан БК на основе клеток гриба R. oryzae, иммобилизованных в криогель ПВС. Исходно для иммобилизации был взят споровый грибной материал.
Из литературных данных известно, что оптимальная концентрация спор для иммобилизации грибных культур в гелевые носители составляет (З- б)хЮ6 спор/мл [100, 111]. В данной работе была использована суспензия спор с концентрацией 4x106 спор/мл.
Процесс получения БК на основе иммобилизованных клеток гриба состоял из двух основных стадий: 1) включение спор в матрицу носителя, 2) последующее формирование БК как такового - проращивание иммобилизованных спор в гранулах криогеля ПВС до стационарной фазы роста клеток или стабильного (максимального) уровня метаболической активности.
Гранулы с иммобилизованными спорами диаметром 1,5-2,5 мм в концентрации 50 г/л помещали в питательную среду того же состава, что использовалась и для свободных клеток (при этом проводили варьирование таких компонентов, как основной субстрат и источник азота). Концентрация глюкозы в среде составляла 120 г/л. Эксперименты проводили в течении 200 ч при температуре 30С в качалочных колбах с интенсивным перемешиванием (210 об/мин) для обеспечения аэрации среды. Каждые 40 ч БК промывали и переносили в свежую питательную среду.
В процессе прорастания спор и формирования БК независимо от типа использованной среды были выявлены особенности изменения морфологии иммобилизованного мицелия (Рис. 25).
Исходно гранулы криогеля ПВС с иммобилизованными спорами, помещенные в свежую среду для получения МК, были прозрачными (Рис. 25). Следует отметить высокую упорядоченность и регулярность образующейся макропористой структуры криогеля ПВС. Через 8-10 ч культивирования наблюдался активный рост мицелия внутри гранул. Гранулы БК были повсеместно (Рис. 25 б, г, д) пронизаны грибным мицелием. Очевидно, что иммобилизация в криогель ПВС позволяла клеткам гриба адгезироваться на внутренней и внешней поверхности гранул и надежно удерживаться в порах носителя. При этом значение рН среды резко снижалось с 6,2 до 4,5, поэтому в среду добавляли мел, который позволял поддерживать постоянное значение рН среды (-5,8) в процессе формирования БК.
При проведении экспериментов с иммобилизованными клетками определяли концентрацию продукта, следили за динамикой накопления биомассы и увеличением содержания внутриклеточного АТФ в гранулах БК (Рис. 26). Уже после первых 40 ч масса БК увеличилась на 70%, а к 160 ч - в 2,6 раз по сравнению с исходной. Всего было получено 7 г/л сух. иммобилизованной биомассы. Гранулы увеличились в диаметре от 1,5-2,5 до 2-3 мм. Последующего заметного увеличения массы гранул БК не наблюдалось (изменение концентрации биомассы за последующие 40 ч не превысило 5%). Это позволило сделать вывод о том, что формирование БК как такового при использовании питательной среды данного состава длилось в общей сложности 160-180 ч. Также было отмечено снижение влажности гранул БК с 90 до 85%. По-видимому, по мере роста мицелия внутри гранул увеличивалась плотность его упаковки, а питательная среда, присутствующая в порах носителя, вытеснялась из полимерной матрицы.
Определение суммарной концентрации внутриклеточного АТФ внутри гранул БК выявило ее корреляцию с накоплением биомассы. После. завершения процесса формирования БК удельная концентрация внутриклеточного АТФ оставалась на постоянном уровне (5-5-6x10" моль/г сух. иммоб. биомассы), что подтверждало высокий уровень жизнеспособности иммобилизованных клеток (Рис. 26).
