Введение к работе
Актуальность проблемы. Пероксидаза является одним из наиболее интенсивно изучаемых ферментов во всем мире. Впервые она была описана еще в 1901 году академиком А.Н.Бахом. В настоящее время в год публикуется несколько тысяч статей, посвященных этому ферменту. Столь пристальное внимание к пероксидазе обусловлено ее очень широким применением в биоаналитических целях. Наибольшее применение на практике нашла пероксидаза из корней хрена (КФ 1.1.11.7, HRP) Этот фермент широко используется в качестве метки в иммуноферментных наборах, а также для определения различных соединений и детекции пероксида водорода, являющегося продуктом большого количества ферментативных реакций. Определение пероксидазы с помощью хемилюминесцентной реакции окисления люминола является одной из наиболее чувствительных биоаналитических детектирующих систем. Однако HRP обладает рядом существенных недостатков: 1) для достижения высокой чувствительности в хемилюминесцентной системе необходимо использовать специальные соединения -«усилители» (например, л-иодфенол); 2) фермент обладает низкой стабильностью по отношению к инактивации пероксидом водорода; 3) спектр субстратной специфичности не покрывает весь набор анализируемых соединений; 4) низкая эффективность прямого переноса электронов между активным центром и поверхностью электрода не позволят создавать безмедиаторные электрохимические биосенсоры. Поэтому поиск, получение и характеристика новых пероксидаз для аналитической биотехнологии является актуальной задачей.
В настоящее время скрининг источников новых пероксидаз ведется во всем мире. В нашей лаборатории была выделена анионная пероксидаза табака (ТОР) из трансгенных растений, которая обладала рядом уникальных свойств. Например, ТОР катализировала окисление люминола без усилителя на порядок лучше, чем HRP с усилителем, отличаясь при этом большей стабильностью к инактивации перекисью водорода, чем пероксидаза хрена. Также в нашей лаборатории была разработана методика получения рекомбинатного негликозилированного фермента, экспрессированного в клетках E.coli, который был использован для последующей кристаллизации. Анализ кристаллической структуры позволил приступить к белковой инженерии пероксидазы табака методом направленного мутагенеза для повышения ее активности с рядом субстратов, улучшения температурной и операционной стабильности в реакции хемилюминесценции.
Цепи и задачи исследования. Целью данной работы было исследование взаимосвязи структура-функция в рекомбинантной пероксидазе табака и получение мутантных форм фермента с новыми свойствами. Для этого в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
Провести анализ структуры фермента дикого типа и выбрать наиболее
перспективные аминокислотные замены;
Получить мутантные формы пероксидазы табака;
Провести сравнительное изучение субстратной специфичности полученных мутеинов;
Определить кинетические константы для мутантных ферментов в реакции окисления ABTS;
Изучить термостабильность мутантных ТОР;
Изучить свойства наиболее интересных мутантных форм фермента в реакции хемилгоминесцентного окисления люминола;
Исследовать кинетику взаимодействия отобранных мутантных ТОР с пероксидом водорода методом «остановленной струи».
Научная новизна работы. В данной работе получены и охарактеризованы пять новых точечных мутантов ТОР с заменами He37Met, Gln116Trp, PheUOTyr, Thr151Trp, Leu157Trp и один двойной мутант Phe140Tyr/Thr151Trp. Показано, что, используя подход, основанный на введении в белковую глобулу дополнительных остатков триптофана, можно повысить активность фермента с рядом субстратов, в том числе с фенолом - «плохим субстратом» для фермента дикого типа. Показана важная роль остатка Phe140 в обеспечении термостабильности белковой глобулы. Данная аминокислотная замена также приводит к образованию биокатализатора с повышенной стабильностью сигнала в реакции хемилюминесцентного окисления люминола. Методами стационарной и предстационарной кинетики изучено влияние мутаций на стадии взаимодействия фермента с пероксидом водорода и субстратом АБТС и на стабильность соединений I и II.
Практическая значимость работы. Мутантная форма TOP Thr151Trp может быть использована при создании высокочувствительных электрохимических безреагентных биосенсоров, для определения фенолов в различных смесях. Полученная рекомбинантная TOP Phe140Tyr позволяет повысить чувствительность анализа в 5 раз при использовании в качестве системы детекции реакции хемилюминесцентного окисления люминола. Высокая стабильность хемилюминесцентного сигнала у TOP Phe140Tyr также обеспечивает более высокую воспроизводимость результатов анализа и снижает требования к временным характеристикам выполнения отдельных операций.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на Международных конференциях «Biocatalysis-2005» (Санкт-Петербург, 2005), «Biocatalysis-2007» (Москва-Санкт-Петербург, 2007), на Международной конференция «Environmental Biocatalysis» (Испания, Кордоба, 2006), IV Международном Московском биотехнологическом конгрессе "Biotechnology 2007: state of the art and prospects of development" (Москва, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы; 3 статьи и 5 тезисов докладов Международных конференций, подана заявка на патент РФ.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения; обзора
