Введение к работе
Актуальность. Одним из важньж направлений фундаментального изучения люцифераз является вьшснение связи между спектрами биолюминесценции и структурой люциферазы светляков. К настоящему времени известны первичные структуры 17 люцифераз, выделенньж из различньж видов насекомьж, которые состоят из одной полипептидной цепи (542-552 остатков) и имеют сходный аминокислотный состав. Сравнительный анализ первичной и третичной структур люцифераз из различньж источников показывает высокую консервативность аминокислотных остатков, образующих активный центр фермента. Химическая схема реакции, катализируемая этими ферментами, и структура излучателя идентичны, в то же время максимумы спектров биолюминесценции могут варьироваться в интервале от 540 до 620 нм. Это различие в спектрах биолюминесценции до сих пор не нашло единого объяснения.
Литературные данные показывают, что сдвиги в спектрах биолюминесценции могут наблюдаться при мутациях аминокислотных остатков, расположенньж на различньж участках аминокислотной последовательности. Мутации в активном центре фермента приводят как к сдвигу максимума биолюминесценции, так и к изменению формы спектра, при этом в десятки раз уменьшается каталитическая активность люциферазы, ухудшается связывание субстратов с ферментом. В тоже время природные мутации "ключевых" аминокислотных остатков, локализованных вне активного центра, вызывают сдвиги в спектрах биолюминесценции без существенного изменения ферментативной активности.
Таким образом, актуальным является выяснение механизма, благодаря которому реализуются наблюдаемые изменения в спектрах биолюминесценции, особенно при мутациях остатков, локализованных вне активного центра. Это, возможно, позволит получать мутантные формы люциферазы с различными максимумами спектров" биолюминесценции без существенного изменения других физико-химические свойств фермента. Одним из таких остатков, по-видимому, является His433, мутация которого в люциферазе светляков Luciola cruciata случайным мутагенезом привела к сдвигу максимума биолюминесценции от 570 до 610 нм без существенного изменения ферментативной активности. В связи с этим исследование остатка His433 вызывает интерес, поскольку он высококонсервативен для всех люцифераз насекомьж, не входит в активный центр, но его мутации могут изменить спектр биолюминесценции.
С другой стороны, исследование биолюминесцентной системы имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, поскольку люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различньж биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo. Абсолютная специфичность люциферазы по отношению к АТФ (аденозин-5'-
ГОС, НАЦИОНАЛЬНАЯ БЫиЛМОТСКА
*/fw ^6В>
трифосфат), близкий к единице квантовый выход реакции, простота регистрации биолюминесценции обусловили большой интерес к люциферазе как высокоэффективному реагенту, дозволяющему определять ультрамалые концентрации АТФ. Актуальной задачей является получение высокоактивного и высокостабильного АТФ-реагента на основе растворимой рекомбинантной и мутантной люциферазы светляков, что позволит увеличить чувствительность и воспроизводимость определения АТФ, повысить активность АТФ-реагента, снизить расход фермента для получения реагента. Использование люцифераз, генерирующих свет в различной области видимого спектра, открывает дополнительные аналитические возможности для биолюминесцентного микроанализа.
Цели и задачи исследования: *f получить методом сайт-направленного мутагенеза мутантные формы люциферазы
светляков L.tningrelicaпо остатку His433; "f изучить их каталитические свойства, термостабильность, спектры биолюминесценции; J разработать метод получения высокоактивного и стабильного АТФ-реагента на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков.
Научная новизна. С целью выяснения влияния мутаций, локализованных вне активного центра, на физико-химические свойства фермента получены мутантные формы люциферазы светляков L.mingreUca по остатку His433; проведено систематическое сравнительное изучение их каталитических свойств, термостабильности и спектров биолюминесценции. Показана возможность получения мутантной формы люциферазы со сдвигом максимума в спектре биолюминесценции в длинноволновую область без существенного изменения каталитических свойств и термостабильности. С целью объяснения наблюдаемых изменений в спектрах биолюминесценции при мутациях впервые подробно изучена рН-зависимость спектров биолюминесценции исходной и мутантной формы люциферазы; предложен новый подход к трактовке спектров биолюминесценции, позволяющий корректно объяснить имеющиеся в литературе многочисленные данные о влиянии мутаций на спектр биолюминесценции люцифераз светляков. Разработан метод получения высокоактивного, стабильного реагента на основе растворимых рекомбинантных люцифераз светляков, генерирующих свет в различной области видимого света, для определения ультрамалых концентраций АТФ. Использование АТФ-реагента на основе мутантной формы люциферазы с максимумом биолюминесценции 606 нм, создает дополнительные преимущества применения биолюминесцентного метода в анализе.
Практическая значимость работы. Получены продуценты и наработаны высокоактивные мутантные формы люциферазы светляков L.mingrelica с максимумами биолюминесценции в различной области спектра. Разработан метод получения
высокочувствительньж и стабильньж АТФ-реагентов для анализа АТФ на основе растворимой рекомбинангной люциферазы светляков (АТФ-реагент-1) и ее мутантной формы (АТФ-реагент-2) с максимумами биолюминесценции в различной области спектра, аналитические характеристики и стабильность которьж близки.
Апробация работы. Основные . результаты работы были представлены на международных конференциях: 11-м и 12-м Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (США, 2000 и Кембридж, Великобритания, 2002), международных конференциях "Биокатализ-2000 (Москва, 2000) и Биокатализ-2002" (Москва, 2002), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Путцино, 2000), II Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003). Заявка на патент №2004103830 (Москва, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатньж работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего ПО ссылок. Работа изложена на 125 страницах, содержит 30 рисунка и 14 таблиц.
