Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Глава I. СТРУКТУРА ХРОМАТИНА 9
Нуоеосомный уровень организации хроматина 9
Наднуклеосомные уровни организации хроматина 12
Глава 2. СТРУКТУРА НУКЛЕОСОМЫ 16
Особенности гистон - гистоновых и гистон - ДНК взаимодействий в составе нуклеосомы .. 16
Динамика структуры нуклеосомы 21
Действие мочевины на структуру нуклеосомы 21
Влияние температуры на структуру нуклеосомы 24
Влияние ионной силы и рН среды на структуру нуклеосомы 25
Глава 3. ГЙСТОНЫ 29
3.1. Общая физико-химическая характеристика гистонов
Н2А, Н2В, НЗ и Н4 29
3.2. Структура и свойства тетрамера гистонов
(Н3-Н4)2 35
Структура и свойства димера гистонов Н2А-Н2В 37
Структура октамера гистонов (НЗ-Н4~Н2А-Н2В)2
в растворе ....... 40
П. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 48
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48
4,1. Определение степени очистки препаратов гистонов
стр.
от примесей негистоновых белков 50
Измерение квантового выхода флуоресценции ... 51
Измерение анизотропии флуоресценции .. 51
Определение cL -спиральности гистонов ..... 52
Расчет d «спиральности гистонов методом регистрации спектров кругового дихроизма 52
Определение cL-спиральности гистонов по гипохромному эффекту 52
Регистрация спектров поглощения тирозинового хромофора. Сольвентно-пертурбационная дифференциальная спектрофотометрия /СПДС/ 54
Тушение собственной флуоресценции гистонов 55
Определение длины волны максимума спектров флуоресценции тирозина в растворе и в составе белков 56
Измерение сдвигов спектров флуоресценции тирозинового хромофора. Параметр В 56
Установка для изучения люминесценции растворов биологических объектов 59
4.9.1, Технические характеристики установки 61
Глава 5. ОСОБЕННОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ И ПОГЛОЩЕНИЯ
ТИРОЗИНОВОГО ХРОМОФОРА В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ
ИВ СОСТАВЕ БЕЛКОВ 65
5.1. Длинноволновой сдвиг спектров флуоресценции тирозина в растворах полиэтиленгликола и
мочевины * 66
-5.2. Изменение положения максимума спектров тирози-
стр.
новой флуоресценции панкреатической рибонук
леази (РНКаза А) и димера гистонов (Н2А-Н2В)
при денатурации 71
Глава б. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ДИМЕРА
ГИСТОНОВ (Н2А-Н2В) 78
6*1« Влияние ионной силы среды на конформацию
димера гистонов (Н2А-Н2В) .. 78
6«2. Послойное (зональное) расположение тирози-
лов в составе димера гистонов (Н2А-Н2В) 89
Глава 7. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТЕТРАМЕРА
ГИСТОНОВ (Н3-Н4)2 93
Глава 8. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОКТАМЕРА
ГИСТОНОВ (Н2А~Н2В-НЗ~Н4)2 108
8.1, Структурная организация октамера гистонов
в растворах с различной ионной силой ....... 109
8.2. Анализ механизма зависимой от концентрации
ассоциации димеров (Н2А-Н2В) и тетра-
мера (Н3-Н4)2 в октамер гистонов (Н2А-Н2В)-
ЧНЗ«Ш02~(Н2А~Н2В) 123
Ш. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130
ВЫВОДЫ 136
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 138
Введение к работе
Одним из актуальных вопросов современной биохимии является вопрос о том, какие молекулярные механизмы лежат в основе структурных перестроек хроматина, происходящих при изменении транскрипционной активности генов. Активный и неактивный хроматин содержит ДНК, ассоциированную с гистонами, однако между этими типами хроматина имеются определенные структурные отличия. Одной из причин этого явления могут служить различия в пространственной организации гистоновых комплексов, входящих в состав нуклео-сом хроматина.
Хроматиновая нить, характерная для любых последовательностей ДНК, состоит из цепи повторяющихся субединиц - нуклеосом, состоящих из фрагмента ДНК длиной 200 пар оснований, накрученного на октамер гистонов (Н2А - Н2В - НЗ - Н4)2, и гистона HI /90, 91/. Эта хроматиновая нить может организовываться в структуры высшего порядка, кульминацией которых является метафазная хромосома. В настоящее время выделяют три основных уровня структурной организации хромосом: нуклеосомный, соленоидный или супер-бидный и цепь петель /8/.
Специфичность гистон-гистоновых взаимодействий в составе нуклеосомы, их взаимодействия с негистоновыми белками, наряду с другими факторами, могут играть важную роль в процессах регуляции генетической активности /151/. В то же время пространственная организация октамера гистонов, являющегося белковым "ядром" нуклеосомы, его структурные переходы остаются во многом неизучены.
Особый интерес представляет изучение влияния условий среды на структуру октамера гистонов, В пределах ядра в процессе жиз-
недеятельности клетки ионная сила может изменяться. ДНК, являясь естественным полианионом, даже при низкой ионной силе среды создает вокруг октамера гистонов эффект локальной высокой ионной силы. Эффекторы различной природы /негистоновые белки, гормоны и другие/ могут пертурбировать окружение гистонов нуклеосо-мы, индуцируя изменения структуры октамера гистонов (Н2А - Н2В -НЗ - Н4)р и нуклеосомы.
Изучение октамера гистонов (Н2А - Н2В - НЗ - Н4)р в модельных опытах в растворе ZlhMctCB 9 имитирующем ионное окружение ДНК, привело к представлению, что структура октамера гистонов чрезвычайно чувствительна к условиям окружающей среды: ионной силой раствора, рН, температуре, концентрации гистонов /133, 61/. Эта чувствительность октамера гистонов затрудняет исследование его традиционными биохимическими методами.
До сих пор окончательно не решен вопрос о механизмах самосборки октамера гистонов. Недостаточно изучены особенности пространственной организации олигомеров гистонов в растворах с высокой ионной силой. К каким структурным изменениям октамера гистонов и их более низкомолекулярных комплексов, димера (Н2А - Н2В.) и тетрамера (НЗ - НЧ^, приводит изменение ионной силы среды? Решение этих вопросов имеет не только частное значение в выяснении структуры и механизмов конформационных переходов олигомеров гистонов, но также важно для понимания общих механизмов структурно-функциональных перестроек хроматина.
Основной целью данной работы является изучение пространственной организации гистоновых комплексов /димера гистонов (Н2А -Н2Б), тетрамера (НЗ - НЧ)р и октамера гистонов/ и исследование зависимости структуры этих комплексов от условий окружающей среды.
В задачу работы входит также разработка методов исследования, не оказывающих влияния на структуру исследуемых белков и чувствительных к тонким конформационным перестройкам олигомеров гистонов,
В результате проведенных исследований разработаны новые спектральные методы исследования, которые расширяют возможности изучения пространственной организации тирозинсодержащих белков (белки класса А) и имеют важное значение для биохимии белков. Одним из достоинств этих методов является то, что они не влияют на структуру исследуемых белков. С их помощью, а также посредством ряда других биохимических методов, выявляющих особенности пространственной организации белков, удалось изучить и определить основные параметры пространственной организации димера гистонов Н2А - Н2В, тетрамера (НЗ - Н^ и октамера гистонов в растворах с различной ионной силой. Полученные параметры могут быть использованы как тесты на нативность получаемых препаратов в ряде лабораторий, изучающих гистоновые комплексы.
Разработана пространственная биохимическая модель димера гистонов Н2А - Н2В.
Установлено, что в диапазоне концентрации AfaCB 0,1 -0,8М, предшествующих ассоциации октамера гистонов, происходят структурные перестройки димера Н2А - Н2В и тетрамера гистонов (НЗ - Н4)р« Показано, что в результате конформационных перестроек формируется структура участков взаимодействия димера и тетрамера, что, в свою очередь, приводит к их ассоциации в ок-тамер гистонов при концентрациях NctC больше 0,8М.
Обнаружен структурный переход октамера гистонов в компактное состояние при увеличении концентрации ШСВ выше 2,4М.
Расчитано, что для ассоциации димеров Н2А - Н2В и тетраме-
ра (ИЗ - №) в октамер гистонов требуется дополнительное связывание 10-12 ионов С в области участков их взаимодействия. Предложен механизм укладки ДНК на глобулярной части октамера гистонов.
Данные исследования показали перспективность изучения параметров флуоресценции тирозиновых хромофоров в составе молекул гистонов для решения актуальных задач биохимии, молекулярной биологии и генетики - изучения структуры гистоновых комплексов, входящих в нуклеосомы хроматина.
