Введение к работе
Актуальность проблемы. Клеточные мембраны являются эффективным барьером для защиты клетки от многих токсических водорастворимых соединений, но не защищают от липофильных ксенобиотиков, которые, легко преодолевая эту границу, могут накапливаться как в самой клетке, так и ее мембране. Одним из важных механизмов защиты клетки и организма в целом от таких ксенобиотиков является биотрансформация - превращение липофильных соединений в гидрофильные и легко удаляемые из организма соединения. Метаболизм огромного числа липофильных ксенобиотиков (лекарств, канцерогенов, пищевых добавок, компонентов загрязнения окружающей среды и др.) осуществляет ферментная система, названная микросомной монооксигеназной системой со смешанными функциями (Omura, Sato, 1964). Монооксигеназная система участвует также в метаболизме гидрофобных эндогенных соединений, включающих стероиды, простагландины, жирные и желчные кислоты и другие. Биотрансформация в большинстве случаев ведет к детоксикации - образованию биологически неактивных метаболитов, однако возможна и активация - превращение нетоксичных и проканцерогеных соединений в продукты с токсическими и канцерогенными свойствами.
Широкая субстратная специфичность монооксигеназной системы обеспечивается множественными формами цитохрома Р450 (CYP) -гемопротеинами, кодируемыми суперсемейством генов CYP (Nelson et al., 1996, Nebert, Russel, 2002). Важным свойством многих цитохромов Р450 является их способность к увеличению активности в ответ на введение различных ксенобиотиков. С описания более 40 лет назад феномена индукции цитохрома Р450 (Conney et al., 1960, Remmer, Merker, 1963) впервые возникло представление о множественности форм цитохрома Р450. По современной номенклатуре все многообразие цитохромов Р450 разделено на семейства и подсемейства (Nebert, Russel, 2002). У млекопитающих насчитывается 17 различных семейств, 4 из которых (СУР 1-4) кодируют ферменты, метаболизирующие ксенобиотики. Особый интерес представляют подсемейства CYP1 A, CYP2B, CYP2C и CYP3A, которые являются главными компонентами микросомной монооксигеназной системы печени млекопитающих. CYP3A, CYP2C и CYP2B участвуют в метаболизме подавляющего числа лекарств, a CYP1A осуществляют метаболическую активацию многих соединений, превращая их в продукты с токсическими и канцерогенными свойствами.
Среди индукторов цитохромов Р450 выделяют несколько групп, различающихся по спектру индуцируемых ими форм цитохрома Р450, типичными представителями которых являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и галогенированные диоксины, барбитураты, рифампицин и дексаметазон, этанол, клофибрат.
К настоящему времени накоплены обширные сведения об индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А (CYP1A1 и CYP1A2) такими ксенобиотками, как ПАУ и галогенированные диоксины, которые активируют транскрипцию генов CYP1A через путь сигнальной трансдукции, зависимый от арилгидрокарбонового рецептора (AhR). Индукторами цитохромов Р450 подсемейства 2В является огромное число структурно неродственных соединений. В механизмах регуляции генов CYP2B главную роль транскрипционных факторов играют ядерные рецепторы - CAR (конститутивный андростановый рецептор) и PXR (прегнановый X рецептор). Гены CYP2A, CYP2C и CYP3A регулируются с участием GR (глюкокортикоидный рецептор), а также PXR и CAR (Honkakoski P., Negishi M., 2000).
С тех пор, как был описан феномен индукции цитохрома Р450, в список индукторов включены уже сотни химических соединений. Однако исследование спектра соединений, которые могут индуцировать различные формы цитохрома Р450, по-прежнему актуально. Исследования последних десятилетий показывают, что индукторами CYP1A являются не только ПАУ и диоксины с планарной структурой, но и соединения иных химических классов (индолы, каротиноиды) (Denison M.S., Nagy S.R., 2003; Krusekopf S. et al., 2003).
Необходимость изучения индуцирующих свойств ранее не исследовавшихся химических соединений определяется функциональной значимостью цитохромов Р450 в детоксикации разнообразных ксенобиотиков и метаболической активации многих соединений в активные канцерогены. Важно знать, как влияют на активность цитохромов Р450 те соединения, которые будут использовать в медицине в качестве лекарственных препаратов или ином качестве, потому что в результате индукции или ингибирования цитохромов Р450 могут изменяться фармакокинетические характеристики лекарств, развиваться токсические последствия. Особый интерес представляют витамины, которые используются не только в качестве микронутриентов, но и в лечебных целях.
Вопрос о том, как физические воздействия на организм влияют на ферменты монооксигеназной системы, долгое время был вне интересов исследователей. Первые сообщения об изменении активности цитохрома Р450 в печени экспериментальных животных в отсутствие химических индукторов появилось в 1988 году (Marin, et al., 1988, Okamoto, et al., 1993). Индукция P450 в отсутствие экзогенного химического индуктора была получена также на культурах клеток (кератиноцитах, клетках гепатом). Такие воздействия, как гидродинамический сдвиг, суспендирование культуры в среде с метшщеллюлозой, ультрафиолет и температура приводили к увеличению в клетках активности CYP1 Al (Monk, et al., 2001, Gonzalez, et al., 2001, Feng, et al., 2002). Одним из главных условий формирования физиологического ответа на физические воздействия является запуск биохимических реакций биологически активными продуктами, полученными
или освобожденными из физиологического «депо» под действием физических факторов. В случае индукции цитохромов Р450 при действии физических факторов логично предполагать наличие эндогенных медиаторов, опосредующих запуск экспрессии соответствующих генов.
Целью настоящей работы являлось исследование влияния химических соединений и физических воздействий на монооксигеназную систему печени экспериментальных животных и выяснение механизмов, лежащих в основе возможного модулирующего действия этих факторов на цитохромы Р450 подсемейства1А.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Охарактеризовать влияние на микросомную монооксигеназную систему печени крыс химических соединений, важных для медицинской практики (перфтордекалина, нифедипина, менадиона, а-токоферола, кверцетина, билирубина), и сравнить с характеристиками монооксигеназной системы при введении животным классических индукторов цитохромов Р450 подсемейства 2В (фенобарбитала) и подсемейства 1А (бензо(а)пирена или 3-метилхолантрена).
Исследовать механизм индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А под действием тех соединений, которые обнаружат способность увеличивать активность этих ферментов. Для этого оценить способность таких соединений вызывать изменение уровней мРНК CYP1A1 и CYP1A2 и белка CYP1A1 и CYP1A2 и исследовать влияние этих соединений на ДНК-связывающую способность Ah рецептора.
Исследовать активность цитохромов Р450 подсемейства 1А в печени крыс при совместном введении классического индуктора и тех соединений, которые обнаружат способность индуцировать цитохромы Р450 подсемейства 1А.
Охарактеризовать микросомную монооксигеназную систему печени крыс, подвергавшихся действию физических факторов, различных по своей природе: сверхвысокочастотных электромагнитных колебаний сантиметрового диапазона, низкоинтенсивного лазерного импульсного излучения инфракрасной области спектра, низкоинтенсивного ультразвука, ионизирующего излучения в малых дозах, умеренно низкой температуры.
Исследовать механизм индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А под действием тех физических факторов, которые будут влиять на активность этих ферментов, и исследовать роль эндогенных соединений в индукции Р450 подсемейства 1А под действием физических факторов.
Основные положения работы, выносимые на защиту.
1. Перфтордекалин, основной компонент искусственной кровезамещающей
среды с газотранспортными свойствами, и лекарственный препарат
нифедипин оказывают влияние на ферменты монооксигеназной системы,
сходное с действием фенобарбитала, увеличивая содержание
CYP2B1/2B2 в микросомах печени экспериментальных животных и
активность CYP2B1. Кроме этого, нифедипин при длительном введении
увеличивает активность CYP3A. а-Токоферол, менадион, пиридин, и
пиридин-К-оксид, являются индукторами ферментов биотрансформации
ксенобиотиков смешанного типа, увеличивая активность CYP1A1,
CYP1A2 и CYP2B1 в печени крыс.
Индукция CYP1A1 и CYP1A2 менадионом и CYP1A1 билирубином в печени крыс осуществляется на транскрипционном уровне с вовлечением сигнального пути Ah-рецептора. Под действием сс-токоферола индукция CYP1A1 реализуется как на транскрипционном уровне с участием AhR-зависимого пути сигнальной трансдукции, так и на посттранскрипционном, а индукция CYP1A2 — на посттранскрипционном уровне.
а-Токоферол, менадион и кверцетин in vivo снижают индуцирующее действие бензо(ос)пирена на активность CYP1A1 и CYP1A2. Ингибирование БП-индуцированных активностей CYP1A1 и CYP1A2 менадионом и кверцетином происходит вследствие снижения уровней мРНК CYP1A1 и CYP1A2. Ингибирующий эффект менадиона и кверцетина на экспрессию генов CYP1A1 и CYP1A2 может быть следствием снижения ДНК-связывающей способности AhR.
Физические факторы, различные по своей природе, при воздействии на организм экспериментальных животных вызывают изменение активности различных форм цитохрома Р450 в печени: под влиянием электромагнитных колебаний сантиметрового диапазона изменяются активности CYP2A, CYP2C11, CYP3A, лазерного импульсного ИК излучения - CYP2B1, CYP2A, CYP2C11, CYP3A, низкоинтенсивного ультразвука - CYP1A1, CYP2A, CYP2C11, ионизирующего излучения в малых дозах - CYP1A2, CYP2A, CYP2C11, умеренно низкой температуры - CYP1А1, CYP1A2, CYP2B1, CYP2C, CYP3A, CYP2E1.
Увеличение активности CYP1A1 в печени крыс под действием ультразвука и холода осуществляется на транскрипционном уровне с вовлечением AhR сигнального пути, а индукция CYP1A2 под действием холода - на посттранскрипционном уровне.
Роль эндогенных посредников в индукции CYP1A1 в печени под действием холода может выполнять ос-токоферол, а под действием ультразвука - билирубин.
Научная новизна
В работе впервые проведено исследование влияния перфтордекалина и нифедипина на ферменты монооксигеназной системы печени. Показано, что перфтордекалин является мощным индуктором фенобарбиталового типа, значительно увеличивающим активность CYP2B1. Показано, что нифедипин при длительном введении вызывает индукцию CYP2B1 и CYP3A.
Впервые показана способность пиридина, пиридин-№оксида, ос-токоферола и менадиона - соединений, непохожих по структуре на классические индукторы CYP1A, увеличивать активность CYP1A1 и CYP1A2 в печени крыс. Установлены механизмы увеличения активности CYP1AI и CYPIA2 под действием менадиона и а-токоферола: индуцирующее влияние менадиона реализуется на транскрипционном уровне через AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции, а индукция ос-токоферолом осуществляется как на транскрипционном уровне через AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции, так и на посттранскрипционном уровне.
Впервые установлено, что билирубин in vivo регулирует экспрессию гена CYP1A1 AhR-зависимым путем.
Показана способность а-токоферола, менадиона и кверцетина ингибировать in vivo индуцируемые бензо(а)пиреном активности CYP1A1 и CYP1A2. Установлен механизм, лежащий в основе ингибирующего эффекта менадиона и кверцетина на бензо(а)пирен-опосредованную индукцию CYP1A1 и CYP1A2, который реализуется на транскрипционном уровне. Ингибирование менадионом и кверцетином бензо(а)пирен-индуцируемых CYP1A1 и CYP1A2 связано со снижения ДНК-связывающей способности AhR.
В работе проведено исследование in vivo влияния различных по природе физических факторов на ферменты монооксигеназной системы печени и впервые показано, что действие физических факторов на организм вызывает изменение активности различных форм цитохрома Р450 в печени.
Обнаружено индуцирующее влияние ультразвука и холода на активность CYP1A1 печени крыс. Показано, что регуляция CYP1A1 в печени при ультразвуковом воздействии осуществляется на транскрипционном уровне AhR-зависимым путем, и одним из эндогенных посредников в индукции CYP1A1 под действием ультразвука является билирубин. Установлен механизм индукции CYP1A1 в печени при воздействии на организм холода, который состоит в транскрипционной активации гена CYP1A1 с участием AhR. Показано, что эндогенным посредником в индукции CYP1А1 под действием холода может быть ос-токоферол.
Научная и практическая значимость.
Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных знаний об индукции цитохромов Р450. В результате исследования влияния химических соединений на активность монооксигеназной системы в список индукторов
цитохромов Р450 подсемейства 1А включены соединения, отличающиеся по химической структуре от классических ПАУ и диоксинов - это пиридин и пиридин-№оксид, обладающие сильными индуцирующими свойствами, а также а-токоферол (витамин Е), менадион (витамин К3) и билирубин, являющиеся слабыми индукторами CYP1A.
Полученные в работе данные демонстрируют неизвестные ранее последствия длительного применения витаминов ЕиК3 в больших дозах -активацию экспрессии генов CYP1A подсемейства, имеющего отношение к метаболизму проканцерогенов.
Данные о снижении индуцирующего действия бензо(а)пирена на экспрессию генов CYP1A1 и CYP1A2 менадионом и кверцетином могут служить теоретической основой для исследования природных слабых индукторов CYP1A и/или активаторов AhR-зависимого пути сигнальной трансдукции. Такие соединения могут быть использованы для предотвращения возникновения и пролиферации гормон-зависимых опухолей за счет перекреста AhR-зависимого пути с путями сигнальной трансдукции рецепторов стероидных гормонов, и, возможно, возникновения опухолей, индуцированных полициклическими ароматическими углеводоролами.
Данные об индукции цитохромов Р450 подсемейств 2В и ЗА нифедипином, широко использующимся лекарственным препаратом, указывают на возможность изменения фармакокинетики лекарств, являющихся субстратами этих форм цитохрома Р450, при одновременном их применении с нифедипином.
Полученные в период доклинических исследований данные о характере влияния перфтордеклина - одного из главных компонентов препарата искусственной крови «Перфторан», на монооксигеназную систему печени, позволили исключить возможность негативных последствий действия препарата на ферменты метаболизма ксенобиотиков. Показан фенобарбиталовый тип индукции цитохрома Р450 перфтордекалином и доказано отсутствие индукции форм цитохрома Р450, ответственных за активацию проканцерогенов и протоксинов.
Исследование активности монооксигеназной системы в печени экспериментальных животных, подвергавшихся воздействию физическими факторами, показало, что индукция цитохромов Р450 является адаптивным ответом не только на чужеродные соединения, попадающие в клетки печени, но и на физические факторы, воздействующие на организм. В отсутствие экзогенных химических соединений роль индукторов цитохромов Р450 могут выполнять эндогенные соединения, уровень которых в организме повышается в ответ на физическое воздействие. Это необходимо учитывать при использовании физических воздействий в терапии. В комплексном лечении с использованием лекарственных препаратов и физиотерапии возможно изменение активности ряда форм цитохрома Р450 и, как следствие,
изменении фармакокинетики лекарств, что может сказаться на эффективности лекарственной терапии.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы
были представлены на 7-й, 8-й Международных конференциях по биохимии,
биофизике цитохрома Р450 (Москва, Россия, 1991; Лиссабон, Португалия,
1993); 5-й Всесоюзной конференции "Цитохром Р450 и модификация
макромолекул" (Ялта, 1989); 3-м Международном симпозиуме по
метаболизму чужеродных соединений (Лондон, Англия, 1989); 8-й
Международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Стокгольм,
Швеция,1990); 3-м Международном ISSX симпозиуме по метаболизму
лекарств (Амстердам, Голландия, 1991); Международном симпозиуме
«Прогресс во внепеченочном метаболизме (Роннеби, Швеция, 1991);
Международной конференции "Изоферменты: Организация и роль в
эволюции» (Новосибирск,1991); Республиканском симпозиуме
"Монооксигеназная система - теоретические и прикладные аспекты" (Ташкент, Узбекистан, 1992); 4-м, 5-м Европейских ISSX симпозиумах (Болонья, Италия, 1992; Тур, Франция, 1993); 3-м Всемирном конгрессе международного общества по адаптивной медицине (Токио, Япония, 1993); 2-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000); 18-м Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирменгем, Англия, 2000); 10-м Греческом фармакологическом конгрессе (Афины, Греция, 2001); Национальной научно-практической конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001); 3-м Съезде биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002); 4-м Съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); 7-й Конференции международного общества по биохимии и молекулярной биологии «Лиганд-рецепторные взаимодейстсвия» (Берген, Норвегия, 2002); Международной конференции «Реактивные формы кислорода и азота, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2003); 13-й Международной конференции по биохимии и биофизике цитохрома Р450 и метаболизму лекарств (Прага, Чешская Республика, 2003).
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов РФФИ N 96-04-50209, N 02-04-48639, N 05-04-48327.
Публикации. По теме диссертации опубликована 71 научная работа. В ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, опубликовано 35 статей.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, главы "Материалы и методы", 6 глав результатов исследований и их обсуждения, заключения и выводов. Она изложена на 219 страницах машинописного текста, включая 30 таблиц и 42 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 499 источников.
