Содержание к диссертации
ВВВДЕНИЕ 7
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
Глава I. ПРОТЕШИТИЧЕСКЙЕ ФЕРМЕНТЫ И ВОСПАЛЕНИЕ... 15
Глава П. ОСНОВНЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕЙНАЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ: МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ, ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ 23
II.І. Альфа-Г-антитрипсин ( *^т- протеиназный ингибитор) .і... 23
П.2. Альфа-2-макроглобулин 29
Глава III. ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ ИНГИБИТОР ПРОТЕЙНАЗ - АПРОТИНИН: СВОЙСТВА, ПРИМЕНЕНИЕ В МІЩИЦИНЕ 37
Глава ГУ. ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ, ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕЙНАЗ И ПАТОЛОГИЯ РОГОВИЦЫ. Л... 42
ГУЛ. Коллагенолитические ферменты 43
ГУ.2. Ферменты фибринолитической системы... 49
ГУ.З. Кислые гидролитические ферменты... Ї Л..,. 53
ГУ. 4. Эндогенные ингибиторы протеолитических ферментов 59
Глава У. КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СЛЁЗНОЙ ЖИДКОСТИ... 66
СОБСТВЕННЫЕ ШСЛЩВАНИЯ... 76
Глава УГ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ . 76
УГ.Г. Экспериментальные модели... 76
УГ.Г.Г. Ожоги роговицы: термический щелочной . ожог роговицы эпихлоргидрином..., 77
УІ.І.2. Герпетический кератит 78
УІ.І.З. Операционная травма 78
УІ.І.4. Иммунизация 79
УІ.2. Обследованные больные 80
УІ.З. Методы измерения активности гидролитичес ких ферментов и антипротеиназ ^
УІ.З.І. Подготовка материала для измерения активности
УІ.3.2. Определение трипсиноподобной активно сти. 81 83
УІ.З.З. Определение антитриптической активно сти 85
УІ.3.4. Определение активности *С 2-макроглобу- лина 87
УІ.3.5. Определение эластазоподобной активно сти 88
УІ.3.6. Определение активности р -глюкуронидазы и В - t^ -ацетилглюкозаминидазы. 90
УІ.3.7. Определение активности кислой фосфа- тазы 91
УІ.4. Исследование белкового состава водянистой влаги и сыворотки крови 92
УІ.5. Исследование фармакокинетики поливалентного ингибитора протеиназ в тканевых структурах глаза 93
Глава УІІ. АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И АНТИПРОТЕИНАЗ В ТКАНЕВЫХ СТРУКТУРАХ ГЛАЗА, ВОДЯНИСТОЙ ВЛАГЕ, СЛЁЗНОЙ ЖИДКОСТИ И ВЫВО РОТКЕ КРОВИ ИНТАКТНЫХ КРОЛИКОВ 95
Глава ПИ. ОСОБЕННОСТИ ДИНАМИКИ АКТИВНОСТИ ПРОТЕО- ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И АНТИПРОТЕИНАЗ В ТКАНЕВЫХ СТРУКТУРАХ И ВОДЯНИСТОЙ ВЛАГЕ ГЛАЗ КРОЛИКОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ ПОВРЕЖДЕ НИЯ ПЕРЕДНЕГО СЕІМЕНТА ГЛАЗНОГО ЯБЛО КА ЮІ
УІІІ.І. Краткая характеристика эксперименталь ных моделей 101
УІІІ.2. Протеолитическая активность 105
УПІ.2.І. Трипсинододобная актив - ность 105
УІІІ.2.2. Эластазоподобная актив ность но
УІІІ.З. Антипротеолитическая активность 115
УІП.З.І. Антитриптическая активность 115
УІІІ.3.2. Активность ^ 2~макРоглобУЛйна 120
Глава П. СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ БЕЛКОВОГО СОСТАВА ВОДЯНИСТОЙ ВЛАГИ И СЫВОРОТКИ КРОВИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ТЕРМИЧЕСКОМ И ЩЕЛОЧНОМ ОЖОГАХ РОГОВИЦЫ 125
Глава X. ИЗМЕНЕНИЕ БАЛАНСА ПР0ТЕ0ЛИТИЧЕСКОЙ И АНТИ- ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ РОГОВИЦЫ 136
X.I. Экспериментальные исследова-
X.2. Исследование сыворотки крови у больных с заболеваниями роговицы Ї42
Пава XI. АКТИВНОСТЬ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И АНТЙПРОТЕИНАЗ В СЛЁЗНОЙ ЖВДКОСТИ КРОЛИКОВ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ РОГОВИЦЫ (ЩЕЛОЧНОЙ ОЖОГ) 150
XI. I. Протеолитические ферменты 152
XI.2. Антипротеиназы .. 157
XI.3. Гликозидазы 163
XI.4. Особенности динамики активности гидролити ческих ферментов и антипротеиназ.в слезной жидкости при различных формах течения ожоговой болезни глаз 169
Глава XII. АПРОТИНИН-ПОЛИВМЕНТНЫЙ ИНПШИТОР ПРОТЖНАЗ В ЛЕЧЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПЕРЩНЕГО ОТДЕЛА ГЛАЗА 174
XII.I. Ожоги роговицы 175
XII.2. Операционная травма 183
XII.3. Сравнительное изучение гордокса и отечественного поливалентного ингиби тора протеиназ 190
Глава XIII. ФАРМАКОКИНЕТИКА ПОЛИВАЛЕНТНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ В ГЛАЗУ ПОСЛЕ ЕГО ИНСТИШШЦИЙ 199
Глава ХІУ. ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И АНТИПРОТЕИНАЗЫ В СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ БОЛЬНЫХ С ЗАБОЛЕВАНИЯ МИ РОГОВИЦЫ 207
ХІУ.І. Герпетический кератит 207
ХІУ.2. Состояние после кератопластики ожоговых бельм 212
ХІУ.З. Решетчатая дистрофия роговицы 214
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 220
ВЫВОДЫ 258
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 264
Введение к работе
Актуальность проблемы. Патология роговицы составляет около 25$ от всех заболеваний органа зрения и имеет высокий удельный вес (до 50$) среди причин снижения зрения и слепоты /30/. Воспалительные заболевания наиболее распространены среди патологий роговицы /17, 45, 86/. Этиология их очень разнообразна -это различные виды травм (механические, ожоговые), инфекции, последствия оперативного вмешательства и др« Важным моментом в лечении воспалительных заболеваний роговицы является предупреждение развития тяжелых деструктивных процессов, последствиями которых может быть образование грубых помутнений, а также глубоких язв и перфораций роговицы, что сопровождается значительным снижением или потерей зрения.
В связи с вышесказанным актуальным является исследование механизмов, лежащих в основе нарушения тонкой структурной организации роговицы при ее заболеваниях. При этом следует учитывать, что воспалительный процесс в роговице не остается локальным, а оказывает влияние на состояние других тканевых структур глаза, особенно в его переднем отделе.
Ведущую роль в деградации компонентов соединительной ткани, типичным представителем которой является строма роговицы, играют протеолитические ферменты /43, 79/. В результате протео-литического распада происходит отторжение поврежденных тканевых элементов, что является необходимым условием нормального течения репаративных процессов, но в то же время чрезмерная активация протеолиза может служить причиной повреждения нативных тканей и расширения очага воспаления. Это особенно опасно для ро говицы, где, незначительное для многих других тканевых образований, усиление воспалительного процесса может привести к существенному ухудшению оптических свойств роговицы и даже создать угрозу ее перфорации.
Однако роль протеолиза далеко не ограничивается расщеплением структурных компонентов тканей. В настоящее время протеолиз принято рассматривать как особую форму биологического контроля, осуществляемого с помощью реакций ограниченного протеолиза /59, 308/. При участии протеолитических ферментов осуществляется регуляция уровня медиаторов воспаления, образование из предшественников активных форм ферментов, участвующих в воспалительной реакции и т.д.
Наиболее универсальным механизмом контроля протеолиза является контроль, осуществляемый ингибиторами протеаз /52/. Установлено, что в основе патогенеза многих заболеваний лежит нарушение баланса между активностью протеолитических ферментов и их " ингибиторов /12, 58, 63/. Имеются отдельные указания на значение некоторых протеолитических ферментов и антипротеиназ в оф-тальмопатологии. Однако в литературе отсутствуют сведения о закономерностях изменения протеиназно-ингибиторного баланса в тканевых структурах глаза в динамике патологического процесса,в том числе в сопоставлении с изменением этого баланса в слезной жидкости и сыворотке крови, что затрудняет решение вопроса об адекватности исследования активности протеиназ и их ингибиторов в этих биологических жидкостях для оценки характера течения патологического процесса в глазу и разработки эффективных методов направленной коррекции протеолиза.
ІІелью настоящей работы явилось изучение закономерностей местных (тканевые структуры глаза, водянистая влага, слёзная жидкость) и общих (периферическая кровь) изменений в протеиназ-но-ингибиторном балансе при патологических процессах в роговице, обоснование целесообразности исследования этого баланса в слёзной жидкости и сыворотке крови для оценки характера течения патологического процесса в глазу и направленной коррекции про-теолиза.
Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:
1. Установить общие закономерности и выявить особенности динамики протеолитической (трипсино- и эластазоподобной) и антипротеолитической (антитриптической и -макроглобулина) активности в тканевых структурах и водянистой влаге глаз кроликов после различных экспериментальных повреждений переднего отдела глаза.
2. Исследовать характер изменения проницаемости барьера кровь - водянистая влага при ожоговой травме роговицы у кроликов на основании изучения поступления во влагу белков с различной молекулярной массой и установить зависимость между проницаемостью этого барьера и протеолитической и антипротеолитической активностью водянистой влаги. Изучить влияние ожоговой травмы глаза кроликов на состав белков сыворотки периферической крови.
3. Изучить закономерности изменения протеиназно-ингибитор-ного баланса в периферической крови у больных с заболеваниями роговицы и у кроликов после экспериментальной травмы глаза.
4. Изучить динамику активности гидролитических ферментов и антипротеиназ в слёзной жидкости при различных патологических состояниях переднего отдела глаза с целью установления степени информативности этих показателей для оценки характера течения патологического процесса в глазу и выбора направленности терапевтического воздействия.
5. Изучить влияние поливалентного ингибитора протеиназ типа апротинина (гордокса) на течение воспалительного процесса в глазу и на активность гидролитических ферментов и антипротеиназ в тканях глаза, слёзной жидкости, сыворотке крови кроликов при различных способах введения препарата.
6. Провести сравнительное исследование влияния гордокса и нового отечественного поливалентного ингибитора протеиназ типа апротинина на течение экспериментального воспалительного процесса в роговице и ферментативную активность в роговице и слёзной жидкости кроликов. Оценить возможность разработки глазной лекарственной формы нового отечественного поливалентного ингибитора протеиназ, изучить его фармакокинетику в тканях глаза.
Нятаюя топтана даддздрводчй;
Впервые проведено исследование протеиназно-ингибиторного баланса в тканевых структурах глаза и водянистой влаге в норме и в динамике воспалительного процесса. Показано, что при различных видах экспериментального повреждения переднего отдела глаза кроликов, приводящих к развитию воспалительной реакции (ожоги роговицы, операционная травма), независимо от вида повреждающего воздействия, в тканевых структурах глаза, как подвергшихся непосредственному воздействию, так и в других образованиях глаза, развивается стереотипная реакция, заключающаяся в увеличении активности протеолитических ферментов,трипсино подобных и эластазоподобных,и одновременном возрастании антипро-теолитического потенциала, степень этих изменений зависит от вида воздействия и стадии процесса.
Впервые при ожогах роговицы изучена динамика белкового состава водянистой влаги как показателя состояния проницаемости барьера кровь-водянистая влага. Выявлены принципиальные различия в изменении проницаемости барьера кровь-водянистая влага при термическом и щелочном ожогах роговицы кроликов и установлено, что существует зависимость между протеиназно-ингибиторным балансом в водянистой влаге и состоянием проницаемости этого барьера.
Впервые установлено, что при патологических процессах в роговице, сопровождающихся значительной деструкцией ее тканей, в периферической крови происходит изменение протеиназно-ингиби-торного баланса, зависящее от стадии патологического процесса и характера его течения. В то же время показано, что операционная травма глаза подобных изменений в периферической крови не вызывает.
На основании изучения активности гидролитических ферментов и антипротеиназ в слёзной жидкости в различные стадии воспалительного процесса в глазу кроликов в сопоставлении с их активностью в роговице показано, что динамика уровня этих показателей в слезе отражает стадийность и характер течения патологического процесса и может явиться объективным критерием для его оценки. Установлено, что патологический процесс, протекающий в одном глазу, вызывает изменение протеолитической и антипротео-литической активности в слезной жидкости парного глаза. Обнаружено, что состояние аутосенсибилизации организма сопровождается увеличением активности -макроглобулина в слёзной жидкости.
Впервые исследовано влияние поливалентного ингибитора протеиназ типа апротинина (при различных способах его введения) на ферментативную активность в тканях глаза и слёзной жидкости, протеиназно-ингибиторный баланс в периферической крови при экспериментальных травмах глаза.
Впервые изучены фармакокинетические параметры проникновения поливалентного ингибитора протеиназ типа апротинина в ткани глаза при его инстилляциях.
nPOTTOQW ЩЧШЮП Р99УЮШРВ ИООлеДОЩШ.
Показано, что исследование активности гидролитических ферментов и антипротеиназ в слёзной жидкости можно использовать в клинической практике в качестве критерия для оценки характера патологического процесса в роговице, его прогноза, а также для проведения обоснованной терапии и ее контроля. Изучение протеи-назно-ингибиторного баланса в периферической крови позволяет проводить оценку генерализованного ответа организма на воспалительный процесс в роговице.
Дано обоснование и разработаны показания к применению поливалентных ингибиторов протеиназ типа апротинина при заболеваниях глаза, обоснованы способы их применения. Показана целесообразность включения поливалентных ингибиторов протеиназ в комплексную терапию ожоговой болезни глаз, офтальмогерпеса, а также после офтальмохирургических вмешательств.
Полученные результаты послужили основанием для разработки глазной лекарственной формы поливалентного ингибитора протеиназ типа апротинина. Проведены экспериментальные исследования в плане разработки первой глазной лекарственной формы поливалентного ингибитора протеиназ на основе нового отечественного препарата.
Основные положения, выносимые на зашиту.
I. При воспалительном процессе в глазу, развивающемся в ответ на различные повреждающие воздействия, в тканевых структурах глаза, находящихся как в области непосредственного действия повреждающего фактора, так и вне ее, происходит увеличение активности протеолитических ферментов (трипсино- и эластазопо-добных) и одновременное возрастание антипротеолитического потенциала. Подобная направленность изменения протеиназно-ингиби-торного баланса в тканевых структурах глаза при воспалении не зависит от вида повреждающего воздействия.
2. Ожог роговицы кроликов вызывает как качественные, так и количественные изменения в составе белков водянистой влаги, которые заключаются в повышении концентрации белков и появлении белков, не обнаруживаемых в водянистой влаге интактных животных. Интенсивность этих изменений отражает состояние проницаемости барьера кровь - водянистая влага и зависит от вида ожога и стадии ожоговой болезни глаз. Существует зависимость между состоянием проницаемости барьера кровь - водянистая влага и активностью в ней протеолитических ферментов и антипротеиназ.
3. При патологических процессах в роговице, сопровождающихся значительной деструкцией ее тканевых структур, в периферической крови происходит изменение протеиназно-ингибиторного баланса, зависящее от стадии патологического процесса и характера его течения, в то время как операционная травма глаза подобных изменений в крови не вызывает.
4. Активность гидролитических ферментов и антипротеиназ в слёзной жидкости является объективным критерием для оценки характера течения патологического процесса в роговице. Сопоставление местных (слеза) и общих (кровь) сдвигов в протеиназно-ин-гибиторном балансе дает объективную информацию, позволяющую прогнозировать течение патологического процесса в глазу, определить направленность и способ коррекции протеолиза.
5. Обоснована целесообразность включения поливалентных ингибиторов протеиназ типа апротинина в комплексную терапию воспалительных и деструктивных процессов в глазу. Показана эффективность применения препарата этой группы - гордокса при ожогах глаз, офтальмогерпесе, для профилактики осложнений после оф-тальмохирургических вмешательств, для предотвращения расплавления роговичного трансплантата после кератопластики. Экспериментально установлено, что при местном применении гордокса происходит нормализация ферментативных процессов в роговице и слёзной жидкости, а также стабилизация проницаемости гематоофталь-мического барьера, а при внутренном введении в более ранние сроки нормализуется протеиназно-ингибиторный баланс в периферической крови.
6. Разработаны экспериментальные предпосылки для создания первой глазной лекарственной формы поливалентного ингибитора протеиназ типа апротинина на основе отечественного препарата, изучены фармакокинетические параметры проникновения его в ткани глаза кроликов при инстилляционном способе введения.
