Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции Величко Елена Юрьевна

Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции
<
Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции
>

Диссертация, - 480 руб., доставка 1-3 часа, с 10-19 (Московское время), кроме воскресенья

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Величко Елена Юрьевна. Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции : диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.04, 03.00.03 / Величко Елена Юрьевна; [Место защиты: Науч.-исслед. ин-т биохимии СО РАМН].- Новосибирск, 2008.- 137 с.: ил. РГБ ОД, 61 09-3/89

Введение к работе

Актуальность темы. Данная работа посвящена изучению молекулярных механизмов гормональной регуляции транскрипции. Известно, что адаптивные свойства гормонов, как правило, реализуются через взаимодействие с геномом клетки, приводя к усилению экспрессии или, напротив, к супрессии отдельных генов. Несмотря на пристальное внимание ученых к данной проблеме многие этапы этого взаимодействия до сих пор неясны. Достаточно полно изучены молекулярные механизмы индукции ключевых ферментов глюконеогенеза при участии гормонов пучковой зоны коры надпочечников и цитозольного рецептора этих гормонов (Mangelsford D. J. et al., 1995; Libri V. et al., 2004). Однако механизмы взаимодействия гормон-рецепторных комплексов с ДНК изучены недостаточно.

В Институте биохимии СО РАМН ранее было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации, в котором принципиальную роль играли стероидные гормоны и липопротеины высокой плотности 3 подкласса (ЛПВП3) (Панин Л.Е., Усынин И.Ф., Харьковский А.В., 1994; 1999). Показано, что функцию переносчика стероидных гормонов в ядра клеток в данном механизме выполняет аполипопротеин A-I (апоA-I) (Панин Л.Е. и др., 1992). Образование биологически активного комплекса стероидный гормон-аполипопротеин A-I протекает в резидентных макрофагах. Затем осуществляется перенос данного комплекса в ядра соматических клеток, где он взаимодействует с депротеинизированными участками ДНК с последующим усилением экспрессии генов. Молекулярные механизмы данного явления во многом еще не раскрыты. К ним следует отнести определение сайтов взаимодействия комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I с ДНК и их роль в активации транскрипции. Так, ранее было показано, что комплекс стероидный гормон (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон-сульфат)-аполипопротеин A-I взаимодействует преимущественно с GCC/CGG-последовательностями в изолированной ДНК (Панин Л.Е. и др., 2002; Panin L.E. et. al., 2003). Однако ряд деталей этого взаимодействия можно выяснить только на синтетических олигонуклеотидах, а не на нативной ДНК. Сегодня это важное и недостающее звено в изучении не только механизмов усиления экспрессии генов, но и копирования ДНК. Решение этих вопросов чрезвычайно актуально для понимания молекулярных механизмов гормональной индукции синтеза белков, их роли в процессах регенерации и пролиферации клеток.

Цель и задачи исследования

Целью данного исследования являлось изучение молекулярных механизмов действия комплексов стероидный гормон (тетрагидрокортизол, кортизол)-аполипопротеин A-I на вторичную структуру синтетических олигонуклеотидов вида (gCC)n и их комплементарных дуплексов, а также на транскрипцию ДНК крысы.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Установить возможные нуклеотидные последовательности сайтов связывания комплексов стероидный гормон-апоA-I (где стероидный гормон – ТГК или кортизол) с ДНК. Определить устойчивость их к действию ДНКазы I и нуклеазы S1 после взаимодействия с комплексом тетрагидрокортизол-апоА-I;

2. Изучить воздействие комплексов стероидный гормон-апоA-I (где стероидный гормон – ТГК или кортизол) на вторичную структуру синтетических олигонуклеотидов и их комплементарных дуплексов;

3. Оценить влияние метилирования олигонуклеотидов вида (gCC/ggC)n на их взаимодействие с комплексом стероидный гормон-апоА-I;

4. Исследовать влияние комплексов стероидный гормон-апоA-I на транскрипцию ДНК in vitro.

Научная новизна работы

Впервые определены минимально достаточные нуклеотидные последовательности, специфично взаимодействующие с комплексом тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I. Найдены концевые нуклеотиды последовательностей, усиливающие связывание с указанным комплексом. Показано, что последовательность, связывающая комплекс тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I и недоступная действию нуклеаз, представляет собой 5`-gg(Cgg)3T3.

Впервые показано, что метилирование оснований в нуклеотидах CpG не препятствует связыванию олигонуклеотидного дуплекса вида gCC/ggC с комплексом ТГК-апоА-I. На модельных олигонуклеотидных дуплексах AnCC(gCC)3gg(Cgg)3Tn (n=0, 3 и 6) доказано «расплетающее» действие комплекса ТГК-апоА-I.

Впервые показано, что комплекс тетрагидрокортизол-аполипопротеин А-I дозозависимо активирует транскрипцию ДНК крысы in vitro, выполняя роль, подобную роли транскрипционного фактора, изменяющего структуру ДНК в сайтах связывания, в процессе транскрипции.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов гормональной регуляции синтеза белков в соматических клетках. Показано, что важную роль в этих механизмах играет такой адресный переносчик стероидных гормонов в ядра клеток как аполипопротеин А-I. Определение минимально достаточного сайта связывания ДНК с комплексом стероидный гормон-аполипопротеин А-I и особенности их взаимодействия существенно дополняют современные представления о структурно-функциональной организации генома эукариот. Полученные данные раскрывают новые механизмы гормональной регуляции экспрессии генов, их роли в регенерации и пролиферации клеток, в том числе, и при опухолевых процессах. Полученные результаты могут быть использованы при обосновании новых методов коррекции и лечения как пролиферативных, так и дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Аполипопротеин A-I в составе комплекса со стероидными гормонами (где стероидный гормон – ТГК или кортизол) имеет высокое сродство как к природной ДНК, так и к GC-богатым синтетическим олигодезоксирибонуклеотидам разного состава.

  2. Связывание комплекса ТГК-апоA-I с олигонуклеотидными дуплексами вида (gCC/Cgg)n приводит к образованию одноцепочечных (S1-нуклеазочувствительных) участков. Метилирование оснований в нуклеотидах не препятствует связыванию комплекса ТГК-апоA-I с комплементарным дуплексом.

  3. Минимально достаточная для связывания комплекса ТГК-апоA-I нуклеотидная последовательность, недоступная действию S1 нуклеазы и ДНКазы I, представляет собой олигонуклеотид gg(Cgg)3T3.

  4. Транскрипция in vitro ДНК крысы, катализируемая РНК-полимеразами белкового экстракта ядер из клеток печени, дозозависимо активируется комплексом ТГК-апоА-I; но при 200-кратном мольном избытке комплекса транскрипция ингибируется полностью.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации изложены в 4 публикациях и были представлены на международной школе молодых ученых (BGRS, Новосибирск, 2005 г.), доложены на ученом совете Института Биохимии СО РАМН.

Структура и объем работы: диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы и 22 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературных источников содержит 195 ссылок, включая 57 отечественных.

  1. Выделение ЛПВП методом изоплотностного ультрацентрифугирования (Hatch F. T., Less R. S., 1968).

  2. Выделение апоА-I из апоЛПВП методом электрофореза по Лэммли (Laemmli U. K., 1970) в препаративном варианте.

  3. Выделение нативной ДНК из печени крысы линии Вистар (Karlinsey J. et al., 1989).

  4. Выделение белкового экстракта из ядер клеток печени крысы по (Dignam J. D. et al., 1983) с собственными модификациями.

  5. Аффинная хроматография олигонуклеотидов.

  6. Введение 32Р-метки в олигонуклеотиды (Маниатис Т. и др. 1984).

  7. Титрование растворов олигонуклеотидов, комплементарных дуплексов и ДНК комплексами стероидный гормон-апоА-I (Гимаутдинова О. И. и др., 1998).

  8. Ферментативный анализ структуры олигонуклеотидов, ДНК и их продуктов с применением нуклеазы S1 (Vogt V.M., 1973), ДНКазы I (Sambrook J., et al., 1989), метилазы M.Fsp4HI и рестриктазы Fsp4HI (Zingg J. M., Jones P. A., 1997; Власова Т. И. и др., 1996).

  9. Реакция транскрипции на матрицах ДНК крысы и хроматина in vitro.

  10. Электрофорез олигонуклеотидов, ДНК и РНК в полиакриламидном геле.

Похожие диссертации на Роль сайтов взаимодействия ДНК с комплексом стероидный гормон - аполипопротеин A-I в регуляции транскрипции