Введение к работе
Актуальность проблемы. Гормональная регуляция экспрессии генов привлекает внимание ученых уже многие десятилетия Это связано с той огромной ролью гормонов, которую они играют в регуляции метаболизма в органах-мишенях, изменяя их функцию в необходимом для организма направлении Адаптивные свойства гормонов, как правило, реализуются через взаимодействие с геномом клетки, приводя к усилению экспрессии или, напротив, к супрессии отдельных генов Однако молекулярные механизмы этого взаимодействия во многих случаях остаются неясными Достаточно полно изучены молекулярные механизмы индукции ключевых ферментов глюконеогенеза под влиянием глюкокортикоидов Они связаны с проникновением гормона в клетку, образованием комплекса с цитозольным рецептором, транслокацией последнего в ядро, где он взаимодействует с определенным акцепторным участком ДНК как транскрипционный фактор, приводя к экспрессии соответствующих генов (Munck A , and Foley R, 1979, Мертвецов Н П , 1990, Mangelsford D J et al, 1995) О сайтах связывания подобных транскрипционных факторов с ДНК имеется довольно обширная информация (Yamamoto К К et al, 1988, Foulkes NS et al, 1992, Quandt К et al, 1995) Аналогичные механизмы действия на геном клеток органов-мишеней рассматриваются в отношении андрогенов (Davies Р and Rushmere NK, 1990, Foulkes NS et al, 1992), эстрогенов (Cavailles V et al, 1995) и других стероидных гормонов Участие стероидных и других гормонов в образовании сложных комплексов гормон-рецептор-ДНК давно является предметом пристального внимания биохимиков (Dalman F С , 1990, Меркулова ТИ и др , 1997, Libn V et al, 2004) Но молекулярные механизмы взаимодействия гормон-рецепторных комплексов с ДНК недостаточно изучены
В Институте биохимии СО РАМН было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации (Панин Л Е , Усынин И Ф , Харьковский А В , 1987, 1994, 1997) Показано, что роль переносчиков стероидных гормонов в организме могут играть липопротеины различных классов ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП (Панин Л Е и др, 1992) В липопротеинах гормоны связаны с белком Таким белком в ЛПВП является аполипопротеин A-I (апоА-1) Поглощая продукты деградации клеток, макрофаги кооперативно захватывают ЛПВП и стероидные гормоны (Панин ЛЕ и др, 1994) В макрофаге происходит дезинтеграция ЛПВП, освобождение аполипопротеина A-I и восстановление стероидных гормонов редуктазами
Тетрагидропроизводные гормонов образуют комплекс с апоА-1, который сначала попадает в интерстициальное пространство, а затем в ядра соматических клеток, где взаимодействует с ДНК (Панин Л Е и др, 1996, Panin L Е et al, 1998, 2000) Показано присутствие аполипопротеинов A-I, В и Е в ядрах гепатоцитов и других клеток т vivo (Панин Л Е, Русских Г С, Поляков Л М, 2000), а также образование и стехиометрия комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I in vitro (Биушкина Н Г и др , 1992)
Молекулярные механизмы взаимодействия стероидных гормонов, аполипопротеинов А-І и Е, их комплексов с ДНК, изменение вторичной структуры ДНК, ее копирование и активация транскрипции впервые подробно изучены в данной работе Актуальность нашего исследования связана не только с расширением представлений об участии стероидных гормонов в комплексе с апоА-І в регуляции экспрессии генов, но и с более глубоким пониманием таких фундаментальных явлений, как процессы внутриклеточной регенерации и пролиферации клеток Цель и задачи исследования.
Целью работы являлось изучение воздействия стероидных гормонов, их метаболитов и аполипопротеинов А-І и Е на структуру эукариотической ДНК, копирование ДНК и транскрипцию генов
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи
Исследовать молекулярные механизмы взаимодействия стероидных гормонов, аполипопротеинов А-І и Е а также комплексов стероид-аполипопротеин с ДНК
Изучить воздействие кортизола, тетрагидрокортизола, андростерона, дегидроэпиандростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата и холестерина на структуру ДНК в отсутствии и в присутствии апоА-I и апоЕ
Определить количественные характеристики связывания апоА-1, комплекса апоА-1-стероид с ДНК и изменения ее вторичной структуры Изучить функциональную роль апоА-1 во взаимодействии с ДНК
Определить нуклеотидные последовательности, моделирующие сайты связывания комплексов апоА-1-стероид с ДНК, оценить характер и специфичность их взаимодействия Найти минимальный сайт связывания комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол с ДНК
Изучить влияние комплексов апоА-1-стероид на копирование ДНК крысы и человека in vitro
Изучить in vitro транскрипцию ДНК с измененной под влиянием комплекса стероидный гормон-апоА-I вторичной структурой
Научная новизна работы. Разработан методический подход для
обнаружения структурных изменений высокомолекулярных ДНК с
использованием флуоресцентного зондирования и ферментативного
анализа Этот подход применен для изучения молекулярных
механизмов взаимодействия ДНК со стероидными гормонами в
комплексе с аполипопротеинами (апоА-I, апоЕ) Впервые обнаружено
образование однонитевых (чувствительных к нуклеазе S1) участков в
результате связывания стероидных гормонов и их метаболитов
(тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон,
дегидроэпиандростерон-сульфат) с ДНК Число таких участков значительно увеличивается в присутствии аполипопротеина A-I, но не аполипопротеина Е Показано, что связывание холестерина -предшественника стероидных гормонов, с нативнои ДНК не приводит к образованию в ней дополнительных одноцепочечных участков Показано и количественно оценено воздействие комплекса апоА-1-стероидный гормон (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон) на вторичную структуру нативнои ДНК
Определена нуклеотидная специфичность и характер распределения по геному крысы одноцепочечных участков, образующихся под влиянием комплекса апоА-1-тетрагидрокортизол Впервые обнаружены нуклеотидные последовательности, регулярно распределенные по геному крысы, специфично взаимодействующие с восстановленной формой кортизола — тетрагидрокортизолом в присутствии аполипопротеина A-I На основании полученных результатов и их сопоставления с литературными данными сделан вывод, что такие последовательности играют важную роль в регуляции экспрессии генов, создавая особые «узнаваемые» матричными ферментами структуры
Показана функциональная роль комплексов апоА-1-
стероидный гормон (тетрагидрокортизол, андростерон,
дегидроэпиандростерон, дегидроэпиандростерон-сульфат) при
взаимодействии с ДНК эукариот, заключающаяся в изменении ее вторичной структуры и, как следствие, активность этих комплексов в процессах транскрипции и репликации ДНК Высказано экспериментально обоснованное положение о функциональной роли комплексов стероидный гормон-аполипопротеина A-I, подобной роли факторов или кофакторов транскрипции и репликации, связанных с регуляцией синтеза белка и внутриклеточной регенерацией Теоретическая и практическая значимость работы. Данные, полученные в процессе решения поставленных в работе задач, имеют фундаментальное значение для развития представлений о паракринной
регуляции, ее роли в механизмах адаптации с участием макрофагов, метаболитов стероидных гормонов и аполипопротеина A-I В работе предложен и подробно изучен in vitro молекулярный механизм регуляции репликации ДНК и транскрипции генов, ключевая роль в котором принадлежит метаболитам стероидных гормонов (тетрагидрокортизол, андростерон) в комплексе с аполипопротеином A-I Найденные в геноме крысы неизвестные ранее структурные элементы и особенности их взаимодействия с ферментами в присутствии аполипопротеина A-I и стероидных гормонов дополняют современные знания о структурно-функциональной организации генома эукариот Полученные в работе результаты важны для анализа молекулярных механизмов взаимодействия в системе макрофаг — опухолевая клетка, макрофаг - лимфоцит и в некоторых других процессах иммунного ответа Выводы, вытекающие из данных работы, вносят существенный вклад в представления о сигнальных трансдукторных системах, участвующих в механизмах регенерации Полученные данные позволят найти новые решения в коррекции дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях, а также при лечении онкологических и иммунных заболеваний Основные положения, выносимые на защиту.
Взаимодействие стероидных гормонов и метаболитов кортизола, тетрагидрокортизола, дегидроэпиандростерона, андростерона, дегидроэпиандростерон-сульфата, с нативной ДНК in vitro приводит к образованию в ней одноцепочечных участков В присутствии аполипопротеина A-I их количество существенно возрастает для стероидов тетрагидрокортизол, андростерон, дегидроэпиандростерон и дегидроэпиандростерон-сульфат Аполипопротеин Е не влияет на количество однонитевых участков в ДНК
Аполипопротеин A-I имеет высокое сродство как к природной ДНК, так и к синтетическим олигодезоксирибонуклеотидам разного состава
3) Связывание комплексов апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол,
дегидроэпиандростерон-сульфат) с нуклеотидными
последовательностями вида (GCC/CGG)n приводит к образованию
одноцепочечных (Sl-нуклеазочувствительных) участков вблизи них
4) Нуклеотидные последовательности ДНК, способные
взаимодействовать с комплексом апоА-1-тетрагидрокортизол с
образованием однонитевых Sl-нуклеазочувствительных участков,
представлены в геноме в количестве, не меньшем, чем 2 на 100 т п н
5) Найден повторяющийся элемент генома крысы размером 5,5 т п н ,
способный дозозависимо связывать комплекс апоА-1-
тетрагидрокортизол с образованием одноцепочечных участков, чувствительных к нуклеазе S1
Синтетические олигонуклеотиды различного состава и длины связываются с апоА-1 и его комплексом с тетрагидрокортизолом В образующихся аддуктах преобладают гидрофобные, а не электростатические взаимодействия
Минимальная нуклеотидная последовательность, связывающая комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол в синтетических олигонуклеотидах и недоступная действию нуклеаз, представлена 13-15-мером вида 5'-ggCggCggCggT3±lN
Тетрагидрокортизол, но не кортизол, в небольшой степени активирует копирование ДНК, 50-кратный избыток тетрагидрокортизола подавляет копирование Комплексы апоА-1-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) дозозависимо активируют копирование ДНК крысы и человека in vitro Значительный мольный избыток (выше 100-кратного) комплексов апоА-1-стероид полностью подавляет реакцию копирования
9) Комплекс апоА-1-тетрагидрокортизол активирует транскрипцию т
vitro ДНК крысы, катализируемую РНК-полимеразами белкового
экстракта ядер из клеток печени, при 20-кратном мольном избытке
комплекса транскрипция ингибируется
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации изложены в 25 работах, опубликованных в центральных российских и международных реферируемых изданиях Результаты работы были представлены на международном конгрессе "Progressive Scientific Technologies for Human Health" (Украина, Феодосия) в 2003 г, на международном симпозиуме "Molecular mechanisms of cell function regulation (Россия, Тюмень) в 2005 г, международной конференции "Neuroscience for Medicine and Psychology" (Украина, Судак) в 2006 г , на международном симпозиуме «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Россия, Москва-Дубна) в 2007 г, на ученом совете и семинарах НИИ биохимии СО РАМН
Структура и объем работы диссертация изложена на 264 страницах, включая 19 таблиц и 56 рисунков Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Список литературных источников содержит 336 ссылок, включая 67 отечественных
