Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 8
1.1 Эндонуклеаза Serratia marcescens - уникальные свойства фермента 8
1.2 Некоторые биохимические и физико-химические свойства эндонуклеазы 11
1.3 Структура эндонуклеазы 16
1.4 Механизм действия эндонуклеазы 19
1.5 Конформационные особенности субстратов эндонуклеазы 22
1.6 Взаимодействие Mg2+ и других ионов с нуклеиновыми кислотами 28
2 Материалы и методы исследования 35
3 Результаты исследований 44
3.1 Выбор субстрата для последующих исследований 44
3.2 Исследование механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами магния 46
3.2.1 Определение оптимального содержания магния для гидролиза РНК 46
3.2.2 Спектральный анализ РНК и ДНК 47
3.2.3 Кинетический анализ гидролиза ДНК и РНК 57
3.3 Определение предпочтения субстрата при одновременном присутствии в среде ДНК и РНК 58
3.4 Влияние мононуклеотидов на активность эндонуклеазы 61
3.4.1 Влияние нуклеозидмонофосфатов на активность эндонуклеазы 61
3.4.2 Влияние нуклеозидтрифосфатов на активность эндонуклеазы 68
3.5 Обсуждение результатов 73
Заключение 85
Выводы 90
Список литературы 92
- Эндонуклеаза Serratia marcescens - уникальные свойства фермента
- Конформационные особенности субстратов эндонуклеазы
- Выбор субстрата для последующих исследований
- Определение предпочтения субстрата при одновременном присутствии в среде ДНК и РНК
Введение к работе
Актуальность проблемы. Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens — это одна из наиболее изученных бактериальных нуклеаз, проявляющих широкую субстратную специфичность, сведения о которой представлены в большинстве банков данных [Brenda; RSDB; Protein Data Bank; SCOP]. Известны многие физико-химические и биохимические свойства, структура, каталитически значимые аминокислотные остатки, разработаны модели механизма действия данного фермента [Nestle N. et al., 1969а, 1969b; Лещинская И. Б. и др., 1974; Филимонова М. Н. и др., 1980, 1981, 1995,1996, 1997, 1999, 2001, 2003; Biedermann К. et al., 1989; Miller М. D. et al., 1994; Friendhoff P. et al., 1994, 1996; Kolmes B. et al, 1996; Lunin V. Y. et al, 1997; Шляпников С. В. и др, 1999]. Эндонуклеаза S. marcescens представляет ряд эволюционно родственных и широко распространенных в мире про- и эукариот нуклеаз, различающихся физиологической ролью [Lacks S. et al, 1974, 1975; Rosenthal A. L, 1977; Low R. L. et al, 1987; Vincent R. D, 1988; Puyet A. et al, 1990; Muro-Pastor et al, 1992, 1994; Ruiz-Carrillo A. et al, 1987, 1993; Ikeda et al, 1996; Meiss G. et al, 1998; Филимонова M.H, 1999]. Эндонуклеазу производят и применяют в пчеловодстве и молекулярно-биологических исследованиях [Manual "Benzon Nuclease", 1989; Панфилова 3. И. и др, 1983; Детиненко Л.Д. и др,1995]. Продемонстрирована перспективность использования данного фермента в качестве противовирусного препарата при лечении животных [Аликин Ю. С. и др, 1998]. Установлена противоопухолевая активность [Габдуллина Г. К, 1980]. Вместе с этим механизмы регуляции активности эндонуклеазы изучены недостаточно. Недавно были установлены особенности регуляции ДНКазной активности катионами магния, а также соединениями, содержащими катионы ртути и кобальта [Филимонова М. Н. и др, 1997, 2001, Filimonova М. et al, 2003].
Недостаток информации о механизмах регуляции активности эндонуклеазы тормозит формирование объективных представлений о функционировании данного фермента вне- и внутри клетки, ограничивает эффективность и сферы его применения и, вероятно, препятствует его дальнейшему продвижению в практику. Таким образом, механизмы регуляции активности эндонуклеазы требуют углубленного исследования. Изложенное определяет актуальность настоящей работы, в которой представлены результаты анализа действия мононуклеотидов, различающихся природой азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп, и катионов магния на активность эндонуклеазы по отношению к субстратам, отличающимся друг от друга вторичной структурой, степенью спирализации и полимерности.
Цель работы. Целью настоящей работы стало исследование ключевых механизмов регуляции активности эндонуклеазы Serratia marcescens. В соответствии с целью решали следующие задачи:
Определить оптимальное соотношение Mg/Pcy6crpara для гидролиза РНК.
Провести сравнительный анализ влияния катионов магния на конформацию высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК.
Провести кинетический анализ гидролиза высокомолекулярной ДНК, суммарной и транспортной РНК.
Провести оценку гидролиза ДНК и РНК при их одновременном присутствии в среде.
Изучить гидролиз нуклеиновых кислот: высокомолекулярной ДНК и суммарной РНК, - в присутствии мононуклеотидов, различающихся типом азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп.
Научная новизна. Впервые установлено оптимальное для гидролиза РНК соотношение Mg/Ррнк- Показано, что при оптимальном для проявления активности содержании катионов магния происходит изменение вторичной
структуры субстратов: высокомолекулярной ДНК - в пределах В-конформации, суммарной и транспортной РНК - в пределах А-конформации.
Установлен механизм регуляции активности эндонуклеазы катионами магния. Показано, что независимо от конформационных особенностей, степени полимерности и спирализации субстрата, прочность связывания эндонуклеазы с субстратом постоянна и не зависит от наличия в среде катионов магния. Установлено, что в отсутствии катионов магния эндонуклеаза проявляет специфичность к типу гидролизуемого субстрата. Показано, что присутствие Mg отражается на скорости распада фермент-субстратного комплекса с образованием продукта. Установлено, что нуклеозидмонофосфаты не влияют на активность эндонуклеазы по отношению к ДНК и подавляют активность - к РНК, ингибируя фермент по бесконкурентному типу в случае CMP, GMP, UMP и частично конкурентному типу в случае AMP и d AMP. Выявлено, что дезоксирибонуклеозидтрифосфаты не влияют на активность эндонуклеазы ни по отношению к ДНК, ни к РНК, а СТР, GTP, UTP - только к ДНК, и, напротив, подавляют РНКазную активность. Показано, что АТР играет роль положительного эффектора в присутствии РНК и отрицательного - в присутствии ДНК, ингибируя или активируя эндонуклеазу по частично смешанному типу. Установлены механизмы регуляции активности эндонуклеазы мононуклеотидами, различающимися типом азотистых оснований, углеводного остатка и числом фосфатных групп.
Практическая значимость. Установленные механизмы регуляции активности эндонуклеазы повышают эффективность ее применения и способствуют ее дальнейшему продвижению в практику. Результаты определения оптимального соотношения Mg /Ррнк были использованы при разработке антимикробного препарата на основе эндонуклеазы, защищенного Патентом РФ №2337139.
Решение поставленных задач позволило сформулировать следующие основные научные положения, выдвигаемые на защиту:
При оптимальном для проявления активности содержании Mg2+ происходит изменение вторичной структуры субстратов. При этом прочность связывания эндонуклеазы с субстратом в отличие от скорости продуктивного распада фермент-субстратного комплекса, которая многократно меняется, не зависит от наличия в среде Mg , конформационных особенностей, степени полимерности и спирализации субстрата, что лежит в основе механизма регуляции эндонуклеазы Mg2+.
Мононуклеотиды могут служить эффекторами эндонуклеазы, регулируя ее активность, предпочтительно по отношению к РНК, по частично конкурентному, бесконкурентному или частичному смешанному типу, что зависит от их содержания в среде и химического состава, а также содержания в среде Mg и представляет суть механизмов регуляции активности эндонуклеазы мононуклеотидами.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научных конференциях "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2004), "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2007), «Биология - наука 21 века», (Пущино, 2007).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в числе которых 1 патент, 3 статьи, 5 тезисов.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 106 страницах и включает в себя: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, выводы, заключение, список литературы (131 источник, в том числе 84 иностранных). Диссертация содержит 11 таблиц и 24 иллюстрации.
Эндонуклеаза Serratia marcescens - уникальные свойства фермента
Эндонуклеаза S. marcescens - дезоксирибонуклеат (рибонуклеат) - 5 -нуклеотидогидролаза является одной из наиболее изученных бактериальных нуклеаз. Первые сообщения о внеклеточной нуклеазе появились в 1963 году [Лещинская И. Б. и др., 1963; Eaves G. et al., 1963]. В настоящее время сформировалось мнение, что эндонуклеаза - это фермент, проявляющий широкую субстратную специфичность [Nestle N. et al., 1969b; Лещинская И. Б. и др., 1974; Friendhoff P. et al, 1996b; Brenda; RSDB; Protein Data Bank; SCOP]. Она способна гидролизовать одно- и двуцепочечные ДНК и РНК с образованием 5 -моно-, ди-, три-, тетра-, пента- и олигонуклеотидов [Nestle N. et al., 1969а; Лещинская И. Б. и др., 1967, 1974; Львова Т. Н. и др., 1976]. Эндонуклеаза обладает высокой каталитической активностью, которая в несколько раз выше активности стафилококковой нуклеазы и более чем в 30 раз - ДНКазы I [Филимонова М.Н., 1999].
На начальных этапах исследование эндонуклеазы проводили, предварительно выделяя фермент из природных штаммов бактерий [Nestle N. et al., 1969а; Лещинская И. Б. и др., 1974; Филимонова М.Н. и др., 1980]. К началу 90-х годов были достигнуты успехи в изучении экспрессии генов, секреции фермента и получены рекомбинантные штаммы бактерий [Ball Т. К. et al., 1987; Biedermann К. et al., 1989; Friendhoff P. et al., 1994].
Эндонуклеазу S. marcescens (Sma nuc) применяют как средство для лечения и профилактики вирусных заболеваний пчел [Полидорова О. И. и др., 1984; Салганик Р. И. и др., 1985]. Также возможно применение эндонуклеазы в качестве средства профилактики респираторных заболеваний телят, вызываемых ДНК- и РНК-содержащими вирусами различных семейств. Известно таюке, что данный фермент тормозит размножение вирусов везикулярного стоматита и осповакцины в культуре клеток куриных фибробластов [Аликин Ю. С. и др., 1998]. Показана возможность применения эндонуклеазы для получения безвирусных сортов картофеля [Атабеков И. Г. и др., 1990]. Установлено противоопухолевое действие эндонуклеазы, обусловленное ее воздействием на ядерный материал в раковых клетках [Габдуллина Г. К., 1980]. Кроме этого, эндонуклеазу применяют в молекулярной биологии для удаления нуклеиновых кислот из клеточных лизатов [Manual "Вenzon nuclease", 1989].
Есть мнение, что эндонуклеаза S. marcescens участвует в процессах, обеспечивающих бактерии питанием [Беляева М. И. и др., 1976]. Позднее была высказана мысль о возможном участии мононуклеотидов, образуемых в результате гидролиза эндонуклеазой субстратов, в синтезе нуклеиновых кислот [Benedik М. J. et al., 1998]. Однако экспрессия гена пис А, продуктом которого является эндонуклеаза, не регулируется субстратом - добавление в среду нуклеиновых кислот не вызывало индукции этого гена. Так же известно, что добавление нуклеотидов не подавляло транскрипции этого гена [Chen Y.-C. et al., 1992]. Транскрипция гена пис А возрастает при увеличение плотности популяции S. marcescens. В связи с этим предположили, что транскрипция регулируется факторами, относящимися к HSL (acyl-homoserine lactone) сигнальным молекулам. При этом активатором транскрипции гена пис А является протеин NucC, взаимодействующий с а-субъединицей РНК-полимеразы. Известно, также, что экспрессия нуклеазы регулируется бактериальной системой SOS-ответа. При этом белок LexA - репрессор ряда генов, подавляет транскрипцию гена пис A [Benedik М. J. et al., 1998].
В настоящее время известно, что эндонуклеаза S. marcescens является единственной бактериальной нуклеазой, которая представлена несколькими изоформами, различающимися значением изоэлектрической точки. Сначала в препарате эндонуклеазы были обнаружены две белковые фракции с изоэлектрическими точками 6,5 и 7,5 [Филимонова М. Н. и др., 1981]. Позднее было установлено, что количество и соотношение изоформ в препарате нуклеазы может варьировать в зависимости от штамма и условий культивирования бактерий, кроме того, могут варьировать и изоэлектрические точки - от 4 до 8,3 [Biedermann К. et al., 1990]. Было показано, что в очищенном препарате фермента преобладают изоформы Sml (pi 7,4) и Sm2 (pi 6,8) [Филимонова М. Н. и др., 1991]. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей изоформ Sml и Sm2 эндонуклеазы, выполненный пептидным картированием в сочетании с плазменно-десорбционной масс-спектрометрией показал, что единственным отличием первичных структур является гетерогенность в N-концевой аминокислотной последовательности. Зрелой формой нуклеазы является изоформа Sm2. Изоформа Sml отличается от Sm2 тем, что на N-конце отсутствует трипептид Asphr-Leu [Педерсен Ю. и др., 1995]. Кроме того, выявлены различия в составе фракций нуклеотидов, полученных при гидролизе РНК изоформами Sml и Sm2 [Филимонова М. Н. и др., 1996]. Также изоформы отличаются друг от друга чувствительностью к ионам Mg. Так, активность изоформы Sml, при добавлении Mg+2 в реакционную смесь, увеличивается в 4 раза, тогда как у Sm2 - в 9 раз, по сравнению с активностью в отсутствии Mg+2. Очевидно, это связано с различием пространственных структур изоформ, о чем свидетельствует их различие по спектрам кругового дихроизма [Филимонова М. Н. и др., 1997]. Известно, что нуклеаза S. marcescens является представителем ряда эволюционно родственных нуклеаз, в который входят внеклеточная нуклеаза Nuc А цианобактерий {Anabaena sp.), нуклеаза End А стрептококков (S. pneumoniae), митохондриальные нуклеазы дрожжей Nuc 1 (S. cerevisiae) и млекопитающих Endo G (В. taunts) [Филимонова М. Н., 1999; Franke I. et al., 1999]. Перечисленные нуклеазы выполняют различные функции: . Nuc А участвует в обеспечении клеток питанием, End А - в трансформации клеток чужеродной ДНК, Nuc 1 - в процессах рекомбинации и репарации ДНК митохондрий, Endo G - в процессах репликации митохондриальной ДНК, кроме того есть сведения об участии Endo G в апоптозе. Все перечисленные ферменты не проявляют специфичности к углеводному компоненту субстрата и азотистым основаниям, но проявляют чувствительность к вторичной структуре субстрата. Консервативность функционально значимых аминокислот у перечисленных нуклеаз и сходство по биохимическим характеристикам свидетельствуют в пользу общности их механизмов действия [Филимонова М. Н., 1999].
Конформационные особенности субстратов эндонуклеазы
Нуклеаза S. marcescens гидролизует субстраты, различающиеся вторичной структурой, степенью спирализации и полимерности. Вторичная структура молекулы ДНК представляет собой спираль из двух полинуклеотидных цепей, которые удерживаются друг относительно друга водородными связями и гидрофобными взаимодействиями. В зависимости от нуклеотидной последовательности и условий окружающей среды, структура двойной спирали ДНК может варьировать в широких пределах. Так, в зависимости от относительной влажности и солевого состава среды молекула ДНК может существовать в различных конформационных состояниях - А, В, С, Z [Збарский И. Б. и др., 1968; Дэвидсон Д., 1976]. Во всех этих конформациях ДНК сохраняет структуру двойной спирали, но при этом изменяются различные параметры, например: количество комплементарных пар нуклеотидов на один шаг спирали, угол наклона плоскостей оснований к оси спирали, глубина и ширина малой и большой бороздок, направление скручивания спирали. При этом следует добавить, что каждая из конформаций представляет собой обширное семейство конформационных состояний, имеющих близкие, но различающиеся значения некоторых параметров спирали [Drew Н. R. et al., 1981; Нестерова Е. Н. и др., 1998, 1999]. Молекула РНК представляет собой полинуклеотидную цепь, которая в некоторых местах складывается сама на себя, то есть некоторые участки имеют спиральную структуру. Для спиральных участков РНК характерна только А-конформация. Наиболее полимерная РНК, длиной от 1500 до 4000 нуклеотидов, входит в состав рибосом [Збарский И. Б. и др., 1968]. Транспортная РНК, длиной до 90 нуклеотидов, относится к категории относительно низкополимерных РНК клетки. Для нуклеотидного состава тРНК характерно преобладание гуанозина и цитозина (около 60 %), а также высокое содержание минорных оснований [Ашмарин И. П., 1977]. Общие параметры вторичной структуры субстратов, находящихся в различных конформациях, представлены в таблице 2.
В таблице 2 даны усредненные величины параметров спирали, однако в зависимости от нуклеотидной последовательности, эти параметры могут варьировать. Шаг спирали между dG и dC нуклеотидами меньше, чем между dA и dT и составляет 2,0 - 2,5 А. В результате (dG)n:(dC)n -последовательности характеризуются длиной витка спирали в 11,1 пар оснований, а для (dA)n:(dT)n характерен виток длиной в 9,9 пар оснований. Дополнительно (dA)n:(dT)n - последовательности отличаются как от канонической В-формы, так и от (dG)n:(dC)n - последовательности меньшей шириной малой бороздки [Drew Н. R. et al., 1984; Теплухин А. В. и др., 1996].
Есть сведения, что (dG)n:(dC)n - последовательности легче переходят в А-подобную конформацию, чем (dA)n:(dT)n - последовательности [Иванов В. И. и др., 1994]. Устойчивость В-формы (dA)n:(dT)n - последовательности объясняется наличием дополнительных водородных связей из-за присутствующих в малой бороздке молекул воды [Tolstorukov М. Y. et al., 2001]. Более легкий переход (dG)n:(dC)n - последовательности в А-конформацию объясняют способностью цитозина переключать С З endo конформацию сахара [Foloppe N. et al., 1999]. В 50-х гг. было показано, что конформация ДНК чувствительна к степени обводненности (гидратации) [Franklin R. Е. et al., 1953]. Были описаны водные оболочки ДНК в А и В конформациях, а также РНК [Dickerson R. Е. et al., 1982; Berman Н. М. et al., 1999; Arnott S., 1999]. Так в малой бороздке В-ДНК размещаются молекулы воды, формируя один "гидратный хребет" или две небольшие "гидратные полосы", в зависимости от ширины бороздки. Кроме того, фосфатные группы В-ДНК имеют отдельные водные оболочки. При изучении А-ДНК методами рентгено-структурного анализа была выдвинута концепция "экономии воды" [Saenger W. et al., 1986]. Молекулы воды, выстилающие большую бороздку, соединяют соседние фосфатные группы комплементарных цепочек, то есть относительно небольшое количество молекул воды стабилизирует ДНК в А-форме. В случае РНК, молекулы воды формируют водную структуру, сходную с таковой в А-ДНК [Egli М. S. et al., 1996]. Однако гидратные оболочки малой бороздки РНК и ДНК различаются. Малая бороздка РНК содержит гидрофильные С2 -ОН группы рибозы, вследствие чего молекулы воды сосредоточены около этой группы, в отличие от ДНК, где малая бороздка содержит молекулы воды лишь вблизи аденина [Conte М. R. et al., 1996].
Кроме того, было показано, что распределение молекул воды вблизи азотистых оснований зависит от типа основания больше, чем от конформации нуклеотидного остатка [Schneider В. et al., 1993]. Распределение молекул воды вблизи фосфатных групп зависит от конформации ДНК и типа азотистого основания [Schneider В. et al., 1998], при этом молекулы воды образуют отдельные группы около заряженных кислородов фосфатов и практически не встречаются вблизи кислородов фосфодиэфирной связи.
Известно, что особенности конформационного состояния ДНК сильно зависят от свойств ароматических колец азотистых оснований. На основании данных рентгено-структурного анализа, Калладин К. Р. предложил набор простых правил, суть которых сводится к тому, что конформационные особенности различных динуклеотидов обусловлены взаимодействием пуринов в малой бороздке [Calladine С. R., 1982]. Позднее эти правила были дополнены и другими типами стерических и электростатических взаимодействий между азотистыми основаниями [Dickerson R. Е., 1983; Gorin A. A. et al, 1995]. Сахарофосфатный остов оказывает влияние на стэкинг-взаимодействие оснований [Yanagi К. et al., 1991]. Различные параметры, описывающие подвижность плоскостей пар азотистых оснований относительно друг друга и плоскостей комплементарных оснований внутри одной пары азотистых оснований [Dikmann S., 1989], схематически изображены нарис. 3.
Установлено, что такие параметры, как вращение плоскости пары оснований, наклон плоскости пары оснований и шаг спирали зависят только от стэкинг-взаимодействия азотистых оснований. Угол поворота спирали коррелирует с относительной длиной сахаро-фосфатного остова. Наиболее подвижными параметрами являются сдвиг и смещение плоскости пары оснований, вращение плоскости азотистого основания [Packer М. J. et al., 1998]. При этом на два последних параметра оказывает влияние конформационное состояние соседних пар оснований. Сдвиг плоскости пары оснований влияет на длину сахаро-фосфатного остова, а смещение плоскости пары оснований и вращение плоскости азотистого основания - на разницу между длинами двух комплементарных цепей. При этом сдвиг плоскости пары оснований коррелирует с торсионным углом % между Сі сахара и N основания, а смещение плоскости пары оснований - с углами є и С, между Cs и О5, Ps и О5.
Выбор субстрата для последующих исследований
Поставленные задачи решали, используя в качестве субстратов высокополимерную ДНК и РНК. Для этого предварительно охарактеризовали ряд препаратов ДНК и РНК, используемых в лабораторной практике, по содержанию моно-нонануклеотидной фракции, по величине гиперхромного эффекта, обусловленного термоденатурацией или исчерпывающим гидролизом ФДЭ-связей, а также по активности эндонуклеазы по отношению к этим субстратам. Как видно из табл. 3, препарат ДНК из спермы сельди содержал почти в 1,5 раза больше моно- - нонануклеотидов, чем препарат ДНК, выделенной из молок лосося. В частности, кислоторастворимая фракция сравниваемых препаратов, составляла соответственно 90 и 55%. Сравниваемые препараты различались и по величине гиперхромного эффекта, обусловленного исчерпывающим ферментативным гидролизом.
Так для препарата из спермы сельди этот показатель был существенно ниже, чем для ДНК из молок лосося. Напротив, по величине гиперхромного эффекта, обусловленного термо денатурацией, сравниваемые препараты не различались, что свидетельствовало об их идентичности по степени спирализации. Таким образом, препараты ДНК различались главным образом степенью полимерности. В частности препарат ДНК из спермы сельди содержал преимущественно олигонуклеотиды. А препарат ДНК из молок лосося почти наполовину состоял из полинуклеотидов; остальное - одно и двуспиральные олигонуклеотиды. Учитывая результаты анализа, а также то, что активность эндонуклеазы по отношению к ДНК из спермы сельди была почти в 5 раз ниже, чем к ДНК из молок лосося, последняя была выбрана в качестве субстрата для дальнейших исследований.
Как видно из таблицы 3, сравниваемые препараты РНК достоверно не различались ни по содержанию моно- - нонануклеотидов, ни по величине гиперхромного эффекта, вызываемого термоденатурацией или ферментативным гидролизом. Активность эндонуклеазы по отношению к этим препаратам также не имела различий. В связи с этим выбор препарата РНК, для последующего эксперимента был произвольным и соответствовал второму варианту (см. раздел 2). 3.2 Исследование механизма регуляции активности эндонуклеазы катионами магния
Определение особенностей регуляции ДНКазной активности катионами магния и соединениями, содержащими катионы ртути и кобальта [Филимонова М. Н. и др., 1997; 2001; Filimonova М. et al., 2003], приближало к пониманию механизма регуляции активности эндонуклеазы Mg2+ в целом и свидетельствовало о необходимости получения дополнительной информации.
Так, следовало выяснить, будет ли роль Mg при гидролизе РНК идентичной его роли при гидролизе ДНК, повлияет ли на результат степень спирализации РНК, как присутствие в среде Mg2+ отразится на интимном взаимодействии фермента и субстрата. Отвечая на эти вопросы, определяли кинетические параметры гидролиза суммарной и транспортной РНК, а также высокомолекулярной ДНК в присутствии и отсутствии Mg , анализировали изменение конформации субстратов под действием Mg"+. Также определяли оптимальное соотношение Mg /фосфат рцк
Определение оптимального содержания магния для гидролиза РНК Результаты определения активности эндонуклеазы по отношению к РНК при разном содержании катионов Mg представлены на рис. 4. Как видно из рисунка 4, в присутствии 0,58 мМ Mg2+, что соответствовало соотношению Mg2+/фocфaтpнк 2:1, активность нуклеазы возрастала более чем в 3 раза по сравнению с активностью в его отсутствии.
Дополнительное 5-кратное увеличение содержания Mg вызывало дальнейший рост активности: примерно в 2 раза. Последующее увеличение содержания Mg в 2 - 4 раза практически не отражалось на активности нуклеазы. Наблюдаемые в активности изменения были в пределах ошибки опыта. Таким образом, оптимальной для проявления активности по отношению к РНК была концентрация Mg 2,9 - 11,6 мМ, что соответствовало соотношению
Определение предпочтения субстрата при одновременном присутствии в среде ДНК и РНК
Отсутствие принципиальных различий при гидролизе ДНК и РНК в условиях избытка Mg (раздел 2), с одной стороны, и одновременное присутствие этих нуклеиновых кислот в клетках живых организмов, с другой, -вызвали неподдельный интерес к тому, как проходит гидролиз ДНК и РНК эндонуклеазой при одновременном присутствии в среде. При изучении этого вопроса определяли динамику накопления дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов при одновременном присутствии в среде обеих нуклеиновых кислот. В контроле определяли динамику накопления продуктов гидролиза одного из субстратов в отсутствии второго. Результаты представлены на рисунках 12 - 14.
Как видно из рисунка 12, при одновременном присутствии в среде ДНК и РНК под действием эндонуклеазы происходит гидролиз каждого из субстратов с небольшим предпочтением к ДНК, о чем свидетельствует преобладание кислоторастворимых дезоксирибонуклеотидов над рибонуклеотидами на протяжении всего периода наблюдения. При этом в присутствии второго субстрата содержание кислоторастворимых продуктов гидролиза каждого из субстратов снижается примерно в 2,5 раза по сравнению с контролем, что видно из рисунков 13-14 и, очевидно, свидетельствует о том, что гидролиз протекает в одном, общем для обоих субстратов активном центре фермента.
Динамики накопления продуктов гидролиза РНК и ДНК, одновременно присутствующих в реакционной смеси (продукты гидролиза РНК - , продукты гидролиза ДНК - А, содержание продуктов гидролиза РНК и ДНК, рассчитанное из оптического поглощения кислоторастворимой фракции - 0) Динамики накопления продуктов гидролиза ДНК в отсутствии (- 0 -) и присутствии (- -) РНК
Дополнительно из рис. 13 видно, что в отсутствии РНК интенсивный гидролиз ДНК проходит за 7-7,5 мин. За это время в кислоторастворимые продукты переходит более 90% ДНК. Большая часть продуктов гидролиза образуется за первые 3,5 минуты, после чего скорость процесса резко снижается, и кривая постепенно выходит на плато. В присутствии РНК гидролиз ДНК протекает медленнее и продолжается даже через 20 мин после начала реакции. Кривая накопления продуктов гидролиза носит сигмоидальный характер.
Картина гидролиза РНК в присутствии и отсутствии ДНК (рис. 14) во многом сходна с описанной картиной гидролиза ДНК. Так же, как и в случае с ДНК, гидролиз в отсутствии альтернативного субстрата протекает намного интенсивнее, чем в его присутствии. Так же в присутствии альтернативного субстрата кривая гидролиза имеет сигмоидальный характер. В течение первых 3 минут образование кислоторастворимых продуктов незначительное, затем, с 3 по 7 минуты наблюдается резкий рост продуктов гидролиза, после чего реакция выходит на плато. _uc_ [ T . , j , j
Анализ действия нуклеозидмонофосфатов на активность эндонуклеазы представлял интерес в связи с тем, что они входят в число - продуктов гидролиза РНК и ДНК. Результаты представлены в таблицах 8 - 9 и на рисунках Как видно из табл. 8, присутствие 5 -нуклеозидмонофосфатов в эквимолярном к концентрации субстрата количестве отражалось на активности эндонуклеазы. Однако статистический анализ данных показал, что разница значений, полученных в присутствии и отсутствии нуклеотидов, была достоверной лишь в отношении РНКазной активности. Присутствие нуклеотидов приводило к уменьшению РНКазной активности в 1,2 - 1,3 раза. Ни тип углеводного остатка, ни тип азотистого основания в составе нуклеотидов не оказывали существенного влияния на установленный эффект, что следовало из оценки достоверности разницы. В связи с отсутствием аналогичного эффекта по отношению к ДНК дальнейшие исследования, в частности ингибиторный анализ, были ограничены РНКазной активностью эндонуклеазы.
Активность эндонуклеазы (%) в присутствии 0,3 мМ нуклеозидмонофосфатов. Здесь и далее за 100 % принята активность в отсутствии нуклеотидов (контроль)Определение типа ингибирования не выявило принципиальной разницы между AMP и d AMP. Напротив, при графическом представлении результатов ингибирования эндонуклеазы (рис. 15, 16) наблюдалось много общего между этими нуклеотидами. В частности, как видно из рисунка 15, наклон кривых зависимости активности от концентрации субстрата в координатах Рис. 15 Зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата в присутствии (линии 2-4) и отсутствии (линия 1) AMP (А) и d AMP (Б). 1 - О мМ (контроль), 2 - 0,29-, 3 - 0,58-, 4-1,2 мМ мононуклеотида Лайнуивера-Берка при фиксированных концентрациях нуклеотидов, за исключением 1,2 мМ dAMP, увеличивался по сравнению с кривыми, полученными в отсутствии нуклеотидов. За исключением графика для 1,2 мМ dAMP кривые пересекались в точках, лежащих выше оси абсцисс, в области ее положительных значений. Кривая зависимости активности от концентрации субстрата, полученная в присутствии 1,2 мМ d AMP, приближалась к прямой, параллельной оси 1/S. Точка пересечения данной кривой с линией контроля была локализована почти на оси 1/V.
На рисунке 16 представлены графики зависимости от концентрации ингибитора наклона кривых (А и В), которые представлены на рис. 15, и отрезков (Б и Г), отсекаемых этими кривыми от оси ординат (рис. 15). Вновь полученные (вторичные) кривые, независимо от типа ингибитора, были не линейны, а имели форму вогнутой или выпуклой параболы. По классификации Клеланда В. В. [Cleland W. W., 1963, 1979] кривые А и В рисунка 16 можно отнести к случаю гиперболического ингибирования, а кривые Б и Г напоминают случай гиперболической активации.
