Введение к работе
Актуальность проблемы. Известно, что практически во всех типах клеток животных наблюдаются периодические изменения уровня цитоплазматического Са2+ от 10"8-10"7 М до 10"6-10"5 М, причем эти изменения индуцируются различными физиологически активными агентами и обеспечивают, регулируют или, по крайней мере, сопровождают проявление основных функций клеток данного типа. Обычно эти изменения концентрации цитоплазматического Са2+ кратковременны, и после прекращения действия физиологически активного агента клетка быстро возвращается в состояние функционального покоя. Эти процессы обеспечиваются специальными клеточными системами, которые в покое поддерживают внутриклеточную концентрацию Са2+ на низком уровне и обеспечивают его быстрое удаление из цитоплазмы после прекращения действия внешнего сигнала, системами, которые в ответ на этот сигнал обеспечивают вход в клетку Са2+ из окружающей среды или его освобождение из внутриклеточных источников, а также системами, которые отвечают на изменение внутриклеточной концентрации Са2+ изменением своей функциональной активности. Первые два типа систем представлены мембранными белками - Са-насосами, Са-каналами и Са-переносчиками, тогда как последняя система функционирует благодаря существованию в цитоплазме специальных Са-связывающих белков. В настоящее время эти системы хорошо известны, причем, несмотря на огромное разнообразие клеток и выполняемых ими функций, эти системы достаточно универсальны (Orlov et al., 1995). Поддержание низкой концентрации Са2+ в цитоплазме обеспечивается работой специальных мембранных ферментов - Са-АТФаз (Са-насосов) плазматической мембраны и сарко(эндо)плазматического ретикулума, а также работой системы электрогенного Na/Ca-обмена. В цитоплазму клеток Са2+ поступает либо из окружающей среды через Са-каналы плазматической мембраны, либо из внутриклеточных Са-депо - различных компартментов ретикулума, мембраны которого содержат специфические Са-каналы: рианодиновые рецепторы (RyR) и рецепторы инозитол-1,4,5-трифосфата (InsP3R). Настоящая работа посвящена исследованию особенностей регуляции активности Са-каналов и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума мышечной ткани.
Саркошіазматический ретикулум (СР) представляет собой систему сообщающихся цистерн и трубочек, пронизывающих цитоплазму мышечной клетки в непосредственной близости от миофибрилл. В ответ на деполяризацию сарколеммы, возникающую при проведении нервного импульса, в цитоплазму из СР через Са-каналы по градиенту концентрации выходит Са2+, который инициирует образование акгомиозинового комплекса, что приводит к мышечному сокращению (Martonosi, 1984). Увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме, в свою очередь, активирует Са-АТФазу, которая обеспечивает аккумуляцию Са2+ против его градиента во внутреннее пространство СР, в результате чего происходит снижение концентрации Са2+ в цитоплазме и наступает расслабление мышцы (Inesi, 1985).
Са-канал (рианодиновый рецептор) СР - это тетрамерный белок, состоящий
из четырех идентичных субъединиц с молекулярной массой около 560 кДа каждая,
т.е. функционально активный Са-канал имеет молекулярную массу более 2-Ю3 кДа.
В тканях млекопитающих RyR представлен тремя инофирмами l ШШШЬигепенью
гомологии (65-70%) и близкими свойствами. ) POC'J?,'VjitiOTEKA I
З&ш
СПете^ 09
Согласно современным представлениям, каждый полипептид RyR имеет в
своем составе 12 трансмембранных а-спиральных доменов, формирующих канал,
по которому из СР выходит Са2+, и большого цитоплазматического домена,
образованного N-концевой частью молекулы и петлями, соединяющими
трансмембранные а-спирали (Chen et al., 1998). По данным криоэлектронной
микроскопии с высоким разрешением, тетрамерный комплекс RyR напоминает по
форме гриб с квадратными «шляпкой» (27x27x11 нм) и «ножкой» (12x12x6,5 нм)
(Wagenknecht et al., 1997; Sorrentino, Reggiani, 1999). «Ножка» (гидрофобный домен
RyR, формирующий трансмембранный канал) погружена в мембрану СР, а
«шляпка» (гидрофильный домен) соединяет СР с Т-трубочками плазматической
мембраны и взаимодействует с потенциал-чувствительными Са-каналами
плазматической мембраны (дигидропиридиновыми рецепторами, ДГПР). В
скелетных мышцах изменение конформации ДГПР при деполяризации
плазматической мембраны обеспечивает активацию Са-каналов СР за счет
непосредственного «механического» контакта молекул двух каналов (Ogawa et al.,
1999). В сердце активация Са-каналов СР обеспечивается Са2+, который входит в
цитоплазму из внеклеточной среды через ДГПР (так называемый Са-
индуцируемый выход Са2+ из СР). Переход Са-каналов СР в открытое состояние
сопровождается значительными конформационными изменениями,
затрагивающими как гидрофильную, так и гидрофобную части молекулы RyR.
Са-канал СР представляет собой ион-селективный канал с необычайно высокой проводимостью для одновалентных (приблизительно 600 и 750 pS с симметричным 500 мМ Na+ и 250 мМ К1" соответственно) и двухвалентных (примерно 100-150 pS в 50 мМ Са2+ с trans-стороны) катионов.
Установлено, что активность Са-каналов СР регулируется за счет их взаимодействия с рядом белков, как цитоплазматических, так и локализованных в мембранах или внутри полостей СР. Важную роль в регуляции Са-каналов играют триадин и Са-связывающие белки кальмодулин, кальсеквестрин, саркалюменин и богатый гистидином Са-связывающий белок, причем многие из этих белков, как и сам Са-канал СР, могут фосфорилироваться различными протеинкиназами, что приводит к изменению активности Са-каналов. Среди низкомолекулярных соединений, способных активировать Са-каналы СР, наиболее известны Са2+ (в микромолярных концентрациях), адениловые нуклеотиды, кофеин, рианодин (в наномолярных концентрациях), доксорубицин, а также ионы тяжелых металлов и другие модификаторы SH-групп. Ингибиторами Са-каналов СР являются Са2+ и Mg2+ (в миллимолярных концентрациях), рутениевый красный, рианодин (в микромолярных концентрациях), лактат, ряд локальных анестетиков и вещества, разрывающие в белках дисульфидные связи, однако особенности взаимодействия Са-каналов с регуляторами их активности пока до конца не выяснены (Favero, 1999; Ogawa et al., 1999).
Среди причин резкого снижения сократительной активности скелетных мышц при интенсивной работе и развитии утомления основную, хотя и не единственную роль играет изменение свойств Са-каналов СР, приводящее к нарушению нормального процесса обмена Са2+ (Favero, 1999). В частности, сократительная активность утомленных мышечных волокон в значительной степени восстанавливается таким известным активатором Са-каналов СР, как кофеин (Lannergren, Westerblad, 1989). Аналогичным действием обладает эндогенное соединение, в значительных количествах содержащееся в скелетной мускулатуре - гистидинсодержащий дипептид карнозин (Северин и др., 1953).
Этот дипептид не только предотвращает развитие утомления сокращающихся мышечных препаратов, но и восстанавливает сократительную активность утомленных волокон. Это позволяет предполагать, что карнозин может являться эндогенным регулятором функциональной активности Са-каналов СР, однако данные о его взаимодействии с RyR в литературе отсутствуют.
Са-АТФаза СР относится к обширному семейству ион-транспортирующих АТФаз Р-типа (или Е1-Е2-типа), к которому принадлежат Са-АТФаза, Na,K-АТФаза и Н,К-АТФаза плазматических мембран клеток животных, Н-АТФазы ірибов и растений и некоторые АТФазы бактерий, играющие важную роль в обеспечении нормальной жизнедеятельности разных клеток (Moller et al., 1996). Эти ферменты обеспечивают трансмембранный перенос катионов против электрохимического градиента за счет энергии, освобождающейся при гидролизе АТФ. При этом происходит образование промежуточного фосфорилированного интермедиата фермента вследствие переноса терминального фосфорильного остатка АТФ на остаток аспарагиновой кислоты активного центра АТФазы.
Са-АТФаза СР, или SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium-transporting ATPase) в разных тканях млекопитающих представлена несколькими изоформами: SERCA1 - в быстрых скелетных мышцах, SERCA2a - в сердце и медленных скелетных мышцах, SERCA2b - в разных типах клеток (гладкие мышцы, мозг, почки и др.) и SERCA3 - в клетках крови и в различных типах эпителия. SERCA1 образована 994 аминокислотными остатками, расположенными в мембране асимметрично: 70% аминокислотных остатков обращено в цитоплазму, 25% находится в мембране и 5% обращены внутрь СР. Согласно рентгеноструктурному анализу Са-АТФазы СР, проведенному с разрешением в 2,бА, цитоплазматическая часть Са-АТФазы состоит из трех доменов: N-домена (нуклеотидсвязывающего), Р-домена (фосфорилируемого) и адапторного домена А (Toyoshima et al., 2000). Участок фосфорилирования (Asp351) находится на расстоянии 25 А от нуклеотидсвязывающего участка, т. е. домены N и Р в процессе гидролиза АТФ должны приближаться друг к другу. Действительно, в отсутствие Са2+ N-домен находится в фиксированном состоянии, но становится подвижным в его присутствии, а в результате конформационньгх изменений, индуцируемых связыванием АТФ, N-домен приближается к Р-домену. Постулируется, что во время работы фермента А-домен также "способен перемещаться и приводить в движение или заякоривать N-домен. Трансмембранная часть фермента (М) состоит из десяти а-егшралей (М1-М10). Два участка связывания Са2+ находятся в непосредственной близости друг от друга в гидрофобном домене Са-АТФазы и образованы четырьмя спиралями - М4, М5, Мб, М8.
Реакционный цикл Са-АТФазы начинается с того, что фермент, находящийся в конформационном состоянии Е1, связывает два иона Са2+ (с цитоплазматической стороны мембраны) и АТФ. Связывание ионов кальция происходит кооперативно с кажущейся константой связывания 2,3-106 М"'. После связывания кальция фермент фосфорилируется; при этом у-фосфорильный остаток переносится от АТФ на остаток аспарагиновой кислоты (Degani, Boyer, 1973). После фосфорилирования Са-АТФазы АДФ освобождается из активного центра фермента, а фосфат и Mg2+ остаются связанными с ним. Фосфорилирование индуцирует конформационные изменения Са-АТФазы и фермент переходит в состояние Е2. Изомеризация фермента со связанным кальцием приводит сначала к окклюзии ионов кальция внутри гидрофобного домена молекулы фермента, а затем к переносу кальция во внутреннее пространство ретикулума. Вследствие
информационного перехода фермента из состояния Е1 в Е2 сродство Са-АТФазы к ионам Са2+ понижается и они выходят во внутреннее пространство СР. Цикл транспорта Са2+ завершается изомеризацией фермента из конформации Е2 в Е1 после Mg-зависимого гидролиза фосфофермента с освобождением Фн в цитоплазму.
Как и в случае других АТФаз Р-типа, зависимость активности Са-АТФазы СР от концентрации АТФ не описывается уравнением Михаэлиса-Ментен, так как в области высоких концентраций субстрата наблюдается дополнительная активация фермента (Yamamoto, Tonomura, 1967). Это явление получило название аллостерического эффекта АТФ и для его объяснения было предложено несколько моделей функционирования АТФаз Р-типа, ни одна из которых не дает исчерпывающего объяснения имеющихся экспериментальных фактов.
В частности, дополнительная активация Са-АТФазы высокими концентрациями АТФ может быть связана с присутствием в мембранах СР олигомерных комплексов фермента, взаимодействие мономеров в которых и приводит к нарушению нормальной Михаэлисовской кинетики. О возможности существования Са-АТФазы в мембранах СР в виде олигомерных комплексов разного состава говорят многочисленные данные, однако функциональная роль таких комплексов пока не ясна (Murphy, 1976; Andersen, 1989; Maguire, Ohlendieck, 1996).
Установлено, что активность Са-АТФазы СР может регулироваться посредством белок-белковых взаимодействий. Так, активность Са-АТФазы гладких мышц (SERCA2b) ингибируется Са-связывающим белком кальретикулином (Krause, Michalak, 1997), изоформа SERCA2a ингибируется присутствующим в мембранах СР белком фосфоламбаном, фосфорилирование которого цАТФ-зависимой и Са/СаМ-зависимой протеинкиназами снимает это ингибирование (Simmerman, Jones, 1998), а изоформа SERCA1 взаимодействует с белком сарколипином, который в присутствии низких концентраций Са2+ ингибирует, а высоких - активирует фермент (Odermatt et al., 1998). Активность Са-АТФазы СР может модулироваться протеинкиназами и напрямую. Так, фосфорилирование SERCA2a изоформы Са-АТФазы Са/СаМ-зависимой протеинкиназой типа II по остатку Ser38 почти в два раза увеличивает активность фермента (Hawkins et al., 1994). Фосфорилирование Са-АТФазы по этому остатку обнаружено и в нативном работающем сердце, где около 20% белка Са-АТФазы СР находится в фосфорилированном состоянии (Xu et al., 1999).
Интересной моделью для исследования механизмов регуляции обмена Са2+ в разных типах мышц являются животные-гибернаторы, проводящие зиму в состоянии глубокого оцепенения. Они обладают удивительной способностью -выживать при температуре тела близкой к 0С, в то время как понижение температуры тела большинства млекопитающих всего на несколько градусов Цельсия сопровождается изменениями, приводящими к смерти. При гибсрнации большая часть мышц находится в неактивном состоянии. Исключением является сердце, а также диафрагма и межреберные мышцы, обеспечивающие дыхательные движения, и мышцы, поддерживающие характерную позу животного во время спячки. Кроме того, при периодических зимних пробуждениях гибернаторов скелетные мышцы начинают сокращаться уже при низких температурах тела и обеспечивают наибольший вклад в теплопродукцию организма за счет так называемого несократительного и сократительного термогенеза (Lyman et al., 1982; Пантелеев, 1983).
В сердце животных-гибернаторов обнаружены сезонные изменения, затрагивающие функционирование Са-каналов и Са-АТФазы СР (Kondo, 1986; 1988; Kokoz et al., 1997). При гибернации резко возрастает роль СР в обмене внутриклеточного Са2+, так как вход Са2+ в клетки сердца из внеклеточного пространства блокируется в результате фосфорилирования Са-каналов (ДіїIF) плазматической мембраны эндогенными протеинкиназами. Вопрос о том, какие сезонные изменения происходят в СР скелетных мышц, до последнего времени был практически не изучен.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение механизмов регуляции активности Са-каналов (рианодиновых рецепторов) и Са-АТФазы мембран саркоплазматического ретикулума с особым вниманием к возможности их регуляции эндогенными соединениями, регуляторными белками, а также к той роли, которую может играть олигомерная организация Са-насоса в реализации этих путей регуляции. В связи с этим при выполнении работы были поставлены следующие задачи:
Исследовать кофеин-индуцируемый выход Са2+ из СР и провести поиск кофеинсвязывающих белков.
Проанализировать возможность регуляции активности Са-каналов СР гистидинсодержащими дипептидами и оценить их влияние на ингибирование Са-каналов факторами, возникающими в процессе развития мышечного утомления.
Исследовать связывание нуклеотидов с Са-каналами и Са-АТФазой СР с использованием биохимических, физико-химических и физических методов.
Определить олигомерную структуру Са-АТФазы в мембранах ретикулума и выяснить, как влияет изменение олигомерной организации Са-АТФазы на активность фермента.
Для выявления потенциальных белков, регулирующих активность ион-транспортирующих АТФаз Р-типа, исследовать характер ингибирования Са-АТФазы СР мелиттином, получить в очищенном виде белки, имеющие мелитгин-подобные детерминанты, и охарактеризовать их влияние на активность Са-АТФазы.
6. Исследовать сезонные изменения, происходящие в мембранах СР
скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus.
Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые показано, что производные 1,4-дигидропиридина - блокаторы и активаторы Са-каналов плазматической мембраны, в концентрациях <10"6 М не влияют на параметры работы Са-каналов (рианодиновых рецепторов) СР. Установлено, что кофеин, адениловые нуклеотиды, гистидинсодержащие дипептиды и ионы Са2* активируют Са-каналы СР, взаимодействуя со специфическими насыщаемыми центрами связывания. Обнаружено, что богатый гистидином Са-связывающий белок с молекулярной массой 170 кДа, участвующий в регуляции Са-каналов СР, способен связывать кофеин.
Впервые показано, что гистидинсодержащий дипептид карнозин и родственные ему соединения активируют Са-каналы СР. Они повышают чувствительность Са-каналов к активирующему действию кофеина, адениловых нуклеотидов и низких концентраций Са2+ и снижают ингибируюшее действие низких концентраций Mg^, высоких концентраций Са2+ и закислення среды. В модельной системе они демонстрируют способность связывать гидроксилрадикал. Поскольку действие гистидинсодержащих дипептидов направлено на снижение влияния факторов, возникающих при интенсивной мышечной работе и
повреждающих Са-каналы, предполагается, что феномен Северина - защита карнозином мышц от утомления при высоких нагрузках, может объясняться, по крайней мере, частично, взаимодействием гистидинсодержащих дипептидов с Са-каналами ретикулума.
Впервые детально исследовано взаимодействие разных нуклеотидов с центрами их связывания Са-каналов СР. Показано, что в нуклеотид-связывающих центрах связываются как адениловые, так и неадениловые нуклеотиды, причем они конкурируют за эти центры. Связывание адениловых нуклеотидов активируют Са-каналы СР, повышая их чувствительность к Са2+, тогда как неадениловые нуклеотиды такой способностью не обладают.
С помощью химической модификации SH-групп Са-АТФазы СР НБД-хлоридом и анализа флуоресценции меченой Са-АТФазы установлено, что молекула фермента обладает высокой конформационной подвижностью. Зарегистрированы специфические изменения конформации Са-АТФазы при связывании Са2+ и адениловых нуклеотидов и показано, что связывание с ферментом неадениловых нуклеотидов не оказывает влияния на его конформацию. Впервые установлено, что в мембранных препаратах СР одновременно присутствуют принадлежащие Са-АТФазе участки связывания АТФ с высоким и низким сродством.
Подтверждены литературные данные, согласно которым гидролиз АТФ Са-АТФазой СР не подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен, так как при высоких концентрациях АТФ наблюдается дополнительная активация фермента. Показано, что зависимость скорости гидролиза АТФ от концентрации субстрата можно удовлетворительно описать суммой уравнений Михаэлиса (гипербола) и уравнения Хилла (сигмоида). Выдвинута гипотеза, согласно которой Са-АТФаза присутствует в мембранах СР в виде мономеров с высоким сродством к АТФ, гидролизующих субстрат согласно кинетике Михаэлиса, и олигомеров, имеющих низкое сродство к АТФ и связывающих субстрат кооперативно, работа которых описывается уравнением Хилла. Гидролиз ГТФ, пНФФ и гидролиз АТФ солюбилизированной неионным детергентом СпЕд Са-АТФазой описывается уравнением Михаэлиса.
С помощью электронной микроскопии, анализа затухания анизотропии фосфоресценции меченой производными эозина" Са-АТФазы и с использованием сшивающих агентов установлено, что в мембранах СР одновременно присутствуют как мономеры, так и олигомеры Са-АТФазы, причем наличие олигомеров характерно и для Е1, и для Е2 конформеров фермента. Олигомеризация Са-АТФазы в мембранах СР, индуцируемая температурной обработкой и добавлением мелиттина в определенных условиях не приводит к ингибированию фермента, но может увеличивать проницаемость мембраны СР для Са2+.
Показано, что мелиттин является необратимым ингибитором Са-АТФазы, причем его взаимодействие с ферментом удовлетворительно описывается в рамках выдвинутой гипотезы о присутствии в мембранах СР мономеров и олигомеров Са-АТФазы. С помощью антимелиттиновых антител выделен в очищенном виде мелитгин-подобный белок с молекулярной массой 67 кДа, и установлено, что он активирует Са-АТФазу СР.
Впервые детально исследованы сезонные изменения активности Са-АТФазы в мембранах СР скелетных мышц гибернирующего суслика S.undulatus. В мембранных препаратах СР суслика обнаружена высокая эндогенная протеинкиназная активность и продемонстрировано, что сезонные изменения
активности Са-АТФазы могут быть связаны с изменением уровня фосфорилирования регуляторних белков мембран ретикулума.
Апробадяя работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзных конференциях по транспортным АТФазам (Тбилиси, 1978; Тарту, 1980; Карадаг, 1981; Иркутск, 1987), на Ш, IV и VI Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1978; Ленинград, 1981; Тбилиси, 1989), на Всесоюзном биохимическом съезде (Ленинград, 1981), на VIII Всесоюзной конференции «Биофизика и биохимия мышечной подвижности» (Пушино, 1987), на Международном симпозиуме «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989), на Британско-Российском симпозиуме по биоэнергетике (Саутхэмптон, Великобритания, 1992), на VII, IX и X Международных конференциях, посвященных 1Ча,К-АТФазе и АТФазам Р-типа (Тодсмус, Германия, 1993; Саппоро, Япония, 1999; Эльсинор, Дания, 2002), на 39 Ежегодном симпозиуме биофизического общества США (Сан-Франциско, 1995), на Международной конференции «Мембранная биоэнергетика» (Москва, 1995), на II Съезде Российского биохимического общества РАН (Москва, 1997), на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), на VI Съезде Европейского кальциевого общества (Париж, 2000), Гордоновской конференции «Мышцы: электромеханическое сопряжение» (Нью-Хэмпшир, США, 2003). Результаты работы ежегодно обсуждались на научных семинарах кафедры биохимии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.
Публикации. Автором опубликовано 92 печатные работы. Выносимые на защиту положения наиболее полно представлены в 55 публикациях.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы исследования, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (464 ссылки). Объем работы составляет 330 страниц, включая 247 страниц машинописного текста, 57 рисунков и 27 таблиц.
