Введение к работе
Актуальность темы, Пуриновые нуклеотиды - важнейшие компоненты клетки, участвующие в процессах хранения и передачи наследственной информации, хранения и передачи энергии, сигнальной трансдукции (A.G. Chapman, 1977; Ю.И. Бауков, 2009). Клетка осуществляет строгий контроль биосинтеза и деградации пуриновых нуклеотидов, что является необходимым условием адекватного функционирования всех клеточных процессов, происходящих с их участием (Н. Zalkin, 1992). Однако значительная часть механизмов этого контроля остаётся неизученной (F.I. Ataullakhanov, 2002). Роль гуаниловых нуклеотидов в клетке многогранна и включает синтез ДНК, РНК, белка, процессы G-трансдукции и многочисленные ферментативные реакции, в ходе которых GTP выступает в качестве энергодонора (Ю.И. Бауков, 2009; Е.С. Северин, 2008). Инозин-5'-монофосфат-дегидрогеназа (ИМФДГ; Е.С. 1.1.1.205) - фермент de novo синтеза гуаниловых нуклеотидов, катализирующий превращение инозин-5'-монофосфата (IMP) в ксантозин-5'-монофосфат (ХМР) (L. Hedstrom, 2006). Клетки ряда опухолей, а также эмбриональные ткани характеризуются повышенной экспрессией ИМФДГ, что свидетельствует о важной роли фермента в процессах канцеро- и эмбриогенеза (R.C. Jackson, 1975). Ингибиторы ИМФДГ снижают клеточный пул гуаниловых нуклеотидов и обладают антипролиферативным действием, что является основой их клинического применения для иммунносуппрессивной, противоопухолевой и антивирусной терапии (K.W. Pankiewicz, 2003). Более глубокое понимание регуляторных процессов, протекающих с участием ИМФДГ, может способствовать дальнейшей разработке и совершенствованию лекарственных препаратов-ингибиторов фермента.
В дополнение к коровому (каталитическому) домену в структуре ИМФДГ выделяют эволюционно консервативный домен Бейтмана (субдомен), функциональное назначение которого в настоящее время не установлено (S. Ignoul, 2005). Мутации последовательности гена ИМФДГ-1 человека, кодирующей субдомен, вызывают наследственную форму пигментного ретинита - тяжелого дегенеративного заболевания сетчатки, приводящего к слепоте. Патогенетические механизмы развития этого заболевания неизвестны (A. Aherne, 2004). Аминокислотные замены в субдомене ИМФДГ, как и полное удаление субдомена, не вызывают изменений каталитической активности фермента in vitro (L. Hedstrom, 2008). Данный факт свидетельствует, что развитие пигментного ретинита, по-видимому, не связано с недостатком гуаниловых нуклеотидов в клетках сетчатки, и субдомен ИМФДГ может выполнять какую-то регуляторную роль в обмене пуриновых нуклеотидов, не связанную с основной функцией фермента.
Целью настоящего исследования было изучение функциональной роли субдомена ИМФДГ в процессах обмена пуриновых нуклеотидов.
Согласно поставленной цели было предусмотрено решение следующих задач:
1. Сконструировать мутант Escherichia coli с удаленной последовательностью субдомена ИМФДГ на хромосоме.
Исследовать влияние мутации на способность клетки к поддержанию нормального внутриклеточного пула свободных пуриновых нуклеотидов Е. coli, а также на распределение потока IMP в направлении синтеза гуаниловых и адениловых нуклеотидов.
Изучить изменения протеома Е. coli в ответ на удаление субдомена ИМФДГ.
Найти «неожиданные» фенотипические проявления мутации с помощью методов метаболического фетотипического скрининга.
Изучить влияние точковых мутаций гена ИМФДГ, ассоциированных с пигментным ретинитом, на нуклеотидный метаболизм Е. coli.
Научная новизна. Впервые сконструированы бактериальные штаммы, позволяющие прицельно изучать физиологическую роль субдомена ИМФДГ in vivo. Впервые изучен эффект удаления субдомена ИМФДГ in vivo на нуклеотидые пулы клетки и распределение потоков IMP в направлении синтеза адениловых и гуаниловых нуклеотидов. Впервые показана роль субдомена ИМФДГ в процессах регуляции синтеза адениловых нуклеотидов. Впервые исследован in vivo эффект мутаций, ассоциированных с пигментным ретинитом.
Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в создании новых представлений о роли субдомена ИМФДГ в обмене пуриновых нуклеотидов клетки. Результаты исследования позволяют рекомендовать сконструированную нами мутантную форму Е. coli как модель для исследования функциональной значимости субдомена ИМФДГ. Полученные данные могут быть использованы при рассмотрении патогенетических механизмов развития пигментного ретинита.
Объём и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 143 листах машинописного текста и включают 37 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Указатель литературы содержит 211 источников, из них 12 отечественных и 199 иностранных.
Апробация работы. Основные положения диссетрации доложены и
обсуждены на заседаниях проблемной комиссии «Иммунология,
иммунопатофизиология, иммунопатоморфология» Смоленской
государственной медицинской академии (2006-2009); доложены на 36-й конференции молодых ученых Смоленской государственной медицинской академии (Смоленск, 2008 г.), 12-й конференции молодых ученых онкологического центра Fox Chase (Филадельфия, США, 2007 г.), 13-й конференции молодых ученых онкологического центра Fox Chase (Филадельфия, США, 2008 г.), 2-й конференции «Интеграция метаболизма и геномики» Американской микробиологической ассоциации (Монреаль, Канада, 2007 г.).
Положения, выносимые на защиту:
Штамм Е. coli МР101 (мутация guaBACB ) может быть использован для изучения in vivo физиологической роли субдомена ИМФДГ.
Субдомен ИМФДГ является транс-регулятором de novo синтеза адениловых нуклеотидов из IMP.
Мутации гена ИМФДГ, ассоциированные с развитием пигментного ретинита, вызывают снижение пула адениловых нуклеотидов клетки, но не оказывают влияния на пул гуаниловых нуклеотидов.
