Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
I.I. Основные свойства лактоферрина животных
и человека 8
1.1.1« Химические свойства лактоферрина ... 9
Физико-химические свойства и особенности строения лактоферрина .... 15
Противоникробные свойства лактоферрина .....
Методы определения лактоферрина ... 31
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
2.1. Материалы и методы 35
2.1*1. Образцы молозива и способ их
обработки 37
2.1.2. Выделение лактоферрина
Краткий обзор существующих методов выделения лактоферрина
Выделение лактоферрина по
Q«*^'e*« P. d
2.1.2.3. Выделение лактоферрина по
&Л41 Й. del 39
2.1.3. Определение концентрации белка
по Доури 42
2.1.4. Диск-электрофорез в полиакрила-
мидном геле 43
Метод определения содержания железа .. 46
Метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 46
Стр.
Метод получения антисывороток 48
Реакция диффузионной преципитации в
агаре по Оухтерлони 48
2.1.9. Реакция радиальной иммунодиффузки
по Манчини 49
Иммуноэлектрофорез в геле по Грабару . . 50
Определение бактериостатической активности лактоферрина 53
Статистическая обработка полученных результатов 55
2.2. Результаты исследований 57
Характеристика полученного препарата лактоферрина, методов его выделения и очистки 57
Определение молекулярной массы лактоферрина 62
Получение и анализ специфических антисывороток против лактоферрина ....... 67
Динамика концентрации лактоферрина в секрете молочной железы коров в период лактации 72
Содержание лактоферрина в молоке коров, больных маститом 73
Анализ противомикробной активности препарата лактоферрина 77
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 80
ВЫВОДЫ 91
ПРАКТИЧЕСКИЕ ЛРЩЮШЙІЯ 93
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94
Введение к работе
В Программе КПСС указывается: п Создание наряду с могучей промышленностью процветающего, всесторонне развитого и високопродуктивного сельского хозяйства - обязательное условие построения коммунизма". В Отчетных докладах ЦК КПСС ХХУ и ХШ съездам КПСС вопросам сельского хозяйства отведено особое место. "В нашей стране будет и дальше расти потребление наиболее денных продуктов питания, в частности, молока и мяса", - такую задачу партия ставит на десятую и одиннадцатую пятилетки. В продовольственной Программе СССР, принятой майским (1982 г.) Пленумом ЦК КПСС, важное место отводится развитию молочного животноводства.
Успешное развитие молочного животноводства возможно лишь при условии проведения большой селекционной работы и создания новых высокопродуктивных пород. Для успешного выполнения этой работы необходимо понимание физиологических и биологических закономерностей, глубокое проникновение в сущность обменных процессов в организме сельскохозяйственных животных, точные знания в области иммунологии.
Лактоферрин животных и человека относится к числу неклеточных факторов неспецифического иммунитета. Обнаружение его не только в секрете молочной железы, но и в других биологических жидкостях организма, позволяет считать лактоферрин специфическим биохимическим маркером секретирующей эпителиальной ткани.
Обладая рядом свойств, присущих и другим гликопротеидам, лактоферрин, как это было показано in vitro , вызывает инги-бирование роста многих бактерий, вызывающих такие серьезные
- 5 -заболевания, как маститы, острые желудочно-кишечные заболевания новорожденных. Долгое время считали, что подобный эффект обеспечивается хелатными свойствами лантоферрина. Однако в последние годы в литературе появились данные, указыващие на иной механизм действия лактоферрина, связанный со взаимодействием его непосредственно с бактериальной клеткой или с патогенными факторами, синтезируемыми ею.
Установлено, что концентрация лантоферрина увеличивается в молоке при маститах человека и животных. Подобное изменение концентрации лактоферрина в других биологических жидкостях и тканях организма отмечены при таких заболеваниях человека как панкреатиты, синовиты, бурситы, кандидамикоз и др. Более того, существует предположение, что лактоферрин усиливает действие других факторов специфической и неслепдфичес-кой резистентности организма. Таким образом, определение концентрации лактоферрина в секрете молочной железы и других биологических жидкостях организма в норме и патологии может быть использовано для диагностики целого ряда заболеваний млекопитавдих, в том числе и крупного рогатого скота.
Следовательно, разработка метода выделения и очистки лактоферрина из молозива коров, изучение его биохимических и протиБОМикробных свойств, является актуальным направлением исследований, как в научном, так и в практическом отношениях.
Пели и задачи исследований. Основной целью наших исследований являлось определение оптимальных условий для получения высокоочищенного препарата лантоферрина для лабораторных исследований и практического использования,
Б связи с этим нами решались следующие частные задачи:
I. Выделить высокоочищенный препарат лактоферрина из мо-
-і 6 "*
лозива коров;
Изучить некоторые биохимические свойства лактоферрина;
Получить моноспецифическую антисыворотку против него;
Разработать способ количественного определения концентрации лактоферрина в секрете молочной келезы здоровых и больных маститом коров применительно к отечественной породе крупного рогатого скота;
Провести анализ противомикробных свойств лактоферрина относительно некоторых штаммов микробов.
Научная новизна. Впервые в нашей стране выделен биохимически и иммунохимически чистый препарат лактоферрина из молозива коров черно-пестрой, плановой для Нечерноземной зоны РСФСР, породы; получена моноспецифическая антисыворотка против него, что позволило разработать метод радиальной иммунодиффузии применительно к определению динамики лактоферрина в секрете молочной железы в начальный период лактации и содержанию его в молоке при маститах. Внесены модификации в метод выделения. Определены биохимическая и иммунохимияеская чистота препарата лактоферрина,его молекулярная масса и электрофорет/ичеекая подвишюсть. Выяснено наличие бактериостатического действия лактоферрина на 4 штамма микробов.
Практическая ценность. На основе результатов исследований разработаны и утверндены методическим советом ветеринарно-био-логического факультета МВА "Методические рекомендации по выделению лактоферрина из молозива коров и получению к нему специфической антлсыворотки". Методические рекомендации предназначены для научно-исследовательских учреждений, занимающихся вопросами выделения лактоферрина, изучения его физико-химических свойств, антигенной структуры, противомикробыой активности и т.д.
На защиту выносятся следующие основные положения:
Способ выделения, очистки и некоторые биохимические свойства лактоферрина молозива коров;
Получение моноспепифической антисыворотки против лактоферрина;
Разработка метода радиальной иммунодиффузии примени- , тельно к определению концентрации лактоферрина в секрете молочной железы;
Влияние лактоферрина на рост некоторых бактерий in vitro;
Методические рекомендации по выделению лактоферрина из молозива коров и получению к нему специфической антисыво-роткл.
_ 8 -
