Содержание к диссертации
Введение
І.Обзор литературы
1.1. Общая характеристика семейства малых белков теплового шока 10
1.2. Строение малых белков теплового шока 13
1.3. Функции малых белков теплового шока
1.3.1. Шаперошшя активность sHsp 20
1.3.2. Влияние sHsp на полимеризацию актина и регуляция динамики цитоскелета 25
1.3.3. Участие в регуляции апоптоза 28
1.3.4. Роль в развитии нейродегенеративных заболеваний и катаракты 33
II. Материалы и методы
2.1. Препаративные методы
2.1.1. Экспрессия и выделение Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта 40
2.1.2. Выделение актина 42
2.2. Определение тканевого распределения Hsp22 43
2.3. Методы, использованные для исследования структуры Hsp22
2.3.1. Измерение кругового дихроизма 43
2.3.2. Гель-фильтрация 44
2.3.3. Нативный электрофорез 44
2.3.4. Использование методов химической модификации для изучения четвертичной структуры
2.3.4.1 Модификация диметилсуберимидатом (ДМС) 46
2.3.4.2. Образование дисульфидных связей 46
2.3.5.1 Іеравновесное аналитическое ультрацентрифугирование 46
2.4. Определение протеинкиназной активности 47
2.5. Методы, использованные при изучении взаимодействия Hsp22 с нативным актином
2.5.1. Метод флуоресцентной спектроскопии 48
2.5.2 Метод ультрацентрифугирования 49
2.6. Методы, использованные при изучении взаимодействия 1 lsp22 с Hsp27 и Hsp20
2.6.1. Гель-фильтрация 49
2.6.2. Светорассеяние 50
2.7. Определение шаперонной активности
2.7.1. Определение шаперонной активности с инсулином 51
2.7.2. Определение шаперонной активности с алкогольдегидрогеназой 51
2.7.3. Определение шаперонной активности с роданазой 52
2.7.4. Влияние Hsp22 на агрегацию денатурированного актина 52
2.8. Некоторые аналитические методы
2.8.1. Определение концентрации белка
2.8.1.1. Спектрофотометрический метод 52
2.8.1.2. Метод Брэдфорд 53
2.8.2. S DS-Элскгрофорез в ПААГ 5 3
2.8.3. Иммуноблоттинг 54
III. Результаты исследований
3.1. Разработка метода выделения рекомбинантного Hsp22 человека из E.Coli 56
3.2. Тканевое распределение Hsp22 61
3.3. Структура и некоторые физико-химические свойства Hsp22
3.3.1 Доричная и третичная структура 64
3-3.2 Четвертичная структура 67
3.3.3 Влияние рН на стабильность и структуру Н.чр22 и его К141Е-мутапта 76
3.4. Определение протсинкиназиой активности Hsp22 79
3.5. Hsp22 не ингибирует полимеризацию актина 82
3.6. Взаимодействие I lsp22 с другими малыми белками теплового шока 84
3.7. Сравнение шаперонной активности 1 lsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта 91
IV. Обсуждение результатов
4.1. Выделение и характеристика некоторых физико-химических свойствHsp22 100
4.2. Протеинкиназная активность I Isp22 106
4.3. Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока и возможное участие Hsp22 в регуляции полимеризации актина 108
4.4. Шапсронная активность Hsp22 111
V. Выводы 114
Список литературы 115
- Общая характеристика семейства малых белков теплового шока
- Экспрессия и выделение Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта
- Разработка метода выделения рекомбинантного Hsp22 человека из E.Coli
- Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока и возможное участие Hsp22 в регуляции полимеризации актина
Введение к работе
Молекулярные шапсроны являются важнейшим компонентом универсальной системы, позволяющей клетке выжить в условиях стресса. Эти белки взаимодействуют с полипептидными цепями, находящимися в ненативной конформации, препятствуют их спонтанной агрегации и способствуют ренатурании. Классификация белков теплового шока основана на их молекулярных массах. Наиболее изученными являются белки классов I ЬрбО и Hsp70. При гидролизе АТФ эти белки теплового шока переходят из конформации с высоким сродством к субстрату в конформацию с низким сродством. Рефолдинг субстратов достигается путем осуществления нескольких циклов их ассоциации-диссоциации с белком теплового шока. Другие шапероны, такие как HsplOO и Hsp90 также взаимодействуют с денатурированными белками, однако до сих пор не доказано, обладают ли они АТФ-азноЙ активностью, необходимой для рефолдинга. Малые белки теплового шока (sHsp), одному из которых посвящена эта работа, связываются с частично денатурированными белками АТФ-независимым способом и препятствуют их агрегации. Несмотря на то, что эти белки не способны осуществлять фоддинг своих субстратов, они играют в клетке чрезвычайно важную роль, осуществляя функциональную интеграцию между отдельными компонентами ншперонной системы. sllsp привлекают все большее внимание исследователей благодаря растущему перечню разнообразных функций, которые они выполняют в клетке. Можно выделить три направления, по которым ведутся наиболее интенсивные исследования. Во-первых, это участие sHsp в модуляции и защите цитоскелета. Во-вторых, некоторые sHsp, а именно Hsp27 и Hsp20 неким, пока неустановленным образом участвуют в регуляции сокращения гладких мышц. Наконец, в-третих, sHsp являются ингибиторами программируемой клеточной смерти. Благодаря этому они вовлечены в процессы клеточной пролиферации, дифференциации и злокачественной трансформации. Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые по всем этим и другим направлениям, механизмы действия малых белков теплового шока пока остаются неясными.
Объектами наиболее интенсивного исследования пока являются не все sHsp, а лишь отдельные представители семейства: сс-кристаллины, Hsp27 и Hsp20. В области изучения структуры и функций этих белков был достигнут значительный прогресс. В то же время, буквально в последние годы у млекопитающих было открыто еще несколько sllsp, сведения о которых пока ограничиваются лишь несколькими публикациями. Одним из таких белков является Hsp22. Существует две основные точки зрения о роли этого белка в клетке. Согласно первой, Hsp22 является протеинкиназой, фосфорилируюшей белки по остаткам сери на и треонина. Согласно второй точке зрения Hsp22 является типичным представителем семейства малых белков теплового шока. Однако отсутствие данных о строении этого белка и его шаперонной активности не позволяли сделать однозначные выводы о функциях I Isp22 в клетке.
Возникший в последние годы повышенный интерес к исследованию структуры и свойств малых sllsp в значительной степни связан с достижениями в области молекулярной генетики человека. Было идентифицировано несколько точечных мутаций разных sHsp, в том числе мутация Hsp22 с заменой лизина 141 на остаток глугаминовой кислоты (К141Е-мутант), кореллирующая с развитием наследственной дистальной моторной нейропатии II типа. Некоторые данные литературы свидетельствуют в пользу того, что одна из возможных причин развития этого и других заболеваний - нарушение структуры и свойств sHsp, вызванное заменой консервативного положительно заряженного остатка.
В связи со всем вышесказанным, целью нашем работы было сравнение физико-химических свойств и шаперонной активности Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта. Для осуществления этой цели мы поставили перед собой следующие задачи:
1. Разработать метод выделения рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его точечного мутанта К141Е;
2. Проанализировать тканевое распределение Hsp22;
Исследовать структуру и олигомерное состояние рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его точечного К141Е-мутанта;
Проанализировать возможность образования гетероолигомерных комплексов между Hsp22 и другими малыми белками теплового шока;
Изучить влияние Hsp22 на процесс полимеризации актина;
Исследовать протеинкиназігую активность I Isp22 и сопоставить шаперонную активность белка дикого типа и его К141Е-мутанта с использованием различных модельных белков-субстратов.
Научная новизна и практическая значимость
Разработана процедура выделения рекомбинантного Hsp22 дикого типа и его К141 Е-мутанта, экспрессия которого коррелирует с наследственной дистальной моторной нсйропатисй человека.
По данным спектроскопии КД вторичная структура Hsp22 дикого типа и его К141 Е-мутанта практически не отличаются друг от друга и в основном представлены р-складками и неупорядоченной структурой. В отличие от других малых белков теплового шока Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутант не образуют крупных олигомеров и существуют в виде димеров в широком диапазоне концентраций. В условиях in vitro изолированный Hsp22 не обладает ауто протеи нкиназной активностью и не способен фосфорилировать казеин или гистон.
I Isp22 препятствует агрегации частично денатурированных белков-субстратов, при этом белок дикого типа более эффективно предотвращает агрегацию роданазы и алкогольдегидрогеназы, чем его К141Е-мутант.
Результаты работы расширяют знания в области строения малых белков теплового шока и могут быть использованы при изучении механизмов развития нейродегенеративных заболеваний.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Общая характеристика семейства малых белков теплового шока
В структуре малых белков теплового шока выделяют три участка: N-концевой домен, С-концевой (альфа-кристаллиновый) домен и короткую вариабельную С-концевую последовательность. Как уже было сказано в самом начале обзора литературы, наличие консервативного С-концсвого, или а-кристаллинового домена является главным критерием принадлежности белков к семейству sllsp. Длина этого домена составляет около 80-100 аминокислотных остатков. Гомология между некоторыми sHsp в этом участке достигает 90% [ПО]. N-Концевой домен в целом вариабелен по аминокислотному составу и длине, но в его структуре присутствует несколько полуконсервативных участков. Во-первых, у некоторых sllsp имеется так называемый WDPF-мотив, расположенный близко к N-концу. Он имеет структуру (W/F)(D/F)PF [109, 110]. Данный участок присутствует не у всех sHsp. Кроме этого, ближе к кристаллиновому домену располагается последовательность SRLFDQFFR. Делеции этого участка в рекомбинантном аА- и аВ-кристаллине существенно сказывались на обшей конформации белка и снижали его устойчивость к денатурации при нагревании и под действием мочевины [155]. Как уже отмечалось, на С-конце sHsp располагается короткая вариабельная последовательность. Длина этого участка варьирует, но у большинства si Isp она не превышает 30 аминокислотных остатков.
По многочисленным данным КД-спектроскопии вторичная структура sHsp представлена в основном р-складками [15, 99, 202]. Действительно, по данным рентгеноструктурного анализа Hspl6,5 из Methanocoecus jannaschii, а-кристаллиновый домен состоит из 2 р-листов, в состав которых входит 9 Р-складок. р-Листы разделены короткой сс-спиралью. N-концсвой домен представлен в основном неупорядоченными структурами [96]. В коротком вариабельном С-концевом участке молекулы sHsp удается выявить одну короткую а-спираль и одну Р-складку [96]. По данным ЯМР-спектроскопии этот участок подвижен и экспонирован в растворитель [121].
Интересно отметить, что третичная структура Hspl6,5 сходна со структурой иммуноглобулинов [96]. На данный момент известно несколько групп белков, представляющих собой собственно иммуноглобулины, рецепторы, белки клеточной адгезии и даже компоненты цитоскелета позвоночных, бактерий, грибов и растений, объединенных в так называемое суперсемейство IgSF (immunoglobuline superfamily) [67, 143]. Все эти белки, довольно сильно отличающиеся по первичной структуре, содержат в своей третичной структуре значительное количество р-складок, особым образом уложенных друг относительно друга. Общей чертой всех этих белков является то, что они взаимодействуют с множеством разнообразных партнеров и субстратов. Как известно, важнейшей ролью sllsp является предотвращение агрегации частично денатурированных белков. Ig-подобная структура является удачной конструкцией, способной взаимодействовать с самыми разнообразными субстратами [67].
Реитгеноструктурный анализ Hspl6,9 из пшеницы показал, что его вторичная и третичная структурэ очень похожЬ на структуру Hspl6,5 из Methanococcus jannaschii, несмотря на небольшую общую гомологию между этими белками (23%). Различия в упаковке полипептидной цепи наблюдаются в основном в N-концевом домене и С-концевом вариабельном участке.
Большинство данных литературы указывает на то, что минимальной устойчивой единицей sllsp является димер [45, 96, 207]. По всей вероятности, главную роль в стабилизации димера играют а-кристалл иновые домены. Об этом свидетельствуют данные рентгеноструктурного анализа [96, 207], ЯМР-спектроскопии [15, 16] и рассеяния синхротронного излучения рентгеновских лучей раствором фрагментов ос-кристаллина [53]. Для всех исследованных объектов принцип формирования межсубъединичного контакта одинаков и заключается в обмене р-складками ос-кристаллиновых доменов соседних мономеров, с образованием смешанных р-листов. Детали такого взаимодействия могут различаться. Например, в HspI6,5 из Methanococcus jannaschii в состав р-листа одного мономера входит Р-складка соседнего мономера, при этом образуется достаточно прочный контакт [96], в то время как для аВ-кристаллина предполагается образование дополнительного р-листа, состоящего из четырех р-складок, по две от каждого мономера. При этом межсубъедииичный контакт отличается конформационной подвижностью, что по мнению авторов играет роль при образовании гетсродимера между аА- и otB-кристаллином [53].
Дополнительная стабилизация димера может достигаться за счет так называемых SCM-мотивов (self-complementary motives). В состав этих участков входят заряженные и гидрофобные остатки. При антипараллельном расположении становится возможным замыкание как электростатических, так и гидрофобных контактов между самокомплементарными участками, принадлежащими двум соседним мономерам sHsp. Как правило, в кристаллиновом домене sHsp присутствует два консервативных SCM-мотива [52].
Принято считать, что отличительной особенностью sHsp является их способность образовывать олигомерные комплексы. Несмотря на сходство структур мономеров sHsp, размеры олигомеров и число субъединиц, входящих в их состав, варьирует в широких пределах. Олигомерный комплекс I lsp 16,5 из Methanococcus jannaschii состоит из 24 субъединиц и представляет собой полую сферу с внешним диаметром около 120 ангстрем и внутренним - 65 ангстрем. В стенке полости имеются восемь треугольных и шесть квадратных отверстий [96]. Олигомерный комплекс HspI6,9 из пшеницы состоит из 12 субъединиц, упакованных в 2 диска, каждый из которых представляет собой тример димеров [207]. Модели этих олигомерных комплексов представлены на рис. 2. Олигомеры sHsp млекопитающих обладают более динамичной структурой, чем sHsp растений и микроорганизмов, поэтому закристаллизовать их пока не удалось. Размер sHsp может регулироваться различными посттрансляционными модификациями. Самой важной из них является фосфорилирование под действием различных протеинкиназ [10, 12, 75, 110]. Как правило, фосфорилирование приводит к диссоциации крупных и образованию более мелких олигомеров sHsp [74, 83, 94, 176, 186]. Кроме этого, размер олигомеров может регулироваться S-тиилированием [46] или модификацией метилглиоксалем [179]. Для некоторых sHsp характерно выраженное концентрационно-зависимое равновесие между крупными и мелкими олигомерами, поэтому разведение приводит к их диссоциации [48,152].
Экспрессия и выделение Hsp22 дикого типа и его К141Е-мутанта
К 100 мкл компетентных клеток Е. coli добавляли 10 мкл плазмиды рЕТ23Ь (10 нг/мкл), содержащей полноразмерную копию мРНК Hsp22 дикого типа и инкубировали 30 мин при 4С. Затем проводили трансформацию, для чего клетки подвергали тепловому шоку в течение 45 сек при 42С. Далее к ним добавляли 900 мкл среды LB и культивировали 1 час при 37С. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 3000 g). Осадок клеток суспендировали в 100 мкл среды и рассеивали на среду LB-arap (среда LB, содержащая 1 % агарозы, Fluka), содержащую 0,1 мг/мл ампициллина. Чашки Петри инкубировали при 37С в течение 16-18 часов. Клетки с 1-2 одиночных колоний переносили в 50 - 100 мл среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и культивировали в аэробных условиях при 25С 15-16 часов. Полученную таким образом суспензию клеток переносили в 2 л среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и культивировали в аэробных условиях при 37С до оптической плотности равной 0,6-0,8 при 600 нм. Экспрессию Hsp22 индуцировали добавлением изопропил-р-тиогалактозида до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали культуру 4 часа. Клетки охлаждали до 4С, затем осаждали центрифугированием (15 мин, 5000 g) и суспендировали в 40 мл лизис-буфера (50 мМ трис-IICl, рН 8,0; 0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 14 мМ МЭ, 0,5 мМ ФМСФ). Суспензию хранили при -20С.
Суспензию клеток подвергали двукратной 15 секундной обработке ультразвуком при максимальной частоте и мощности в ультразвуковом дезинтеграторе (USD-A, Wintron Ink.). После этого проводили центрифугирование 20 мин 22000 g. Супернатант собирали, а осадок суспендировали в 20 мл лизис-буфера и повторяли обработку ультразвуком и центрифугирование. К супернатантам, полученным после первого и второго центрифугирований, добавляли сухой сульфат аммония до 30% насыщения и инкубировали 1 час при 4С. Полученный белковый осадок отделяли центрифугированием, затем суспендировали его в 20 - 30 мл буфера Б1 и д нал изо вал и против этого буфера в течение ночи. Диализат подвергали ультрацентрифугированию (1 час, 100000 g). Полученный таким образом грубый препарат Hsp22 подвергали дальнейшей очистке хроматоірафическими методами на хроматографе среднего давления ACTA FPLC, Amersham Pharmacia Biotech. Схема начальных этапов выделения представлена на рис.6
На первом этапе очистки Hsp22 использовали гидрофобную хроматографию на колонке Phenyl-Sepharose Hirap (5 мл). Препарат Hsp22 разводили водой до 80 мл для понижения концентрации белка и предотвращения его высаливания при добавлении высоких концентраций сульфата аммония. Полученный раствор делили на две части и каждую часть подвергали идентичной обработке. К полученному раствору добавляли сухой сульфат аммония до 0,3 М, после чего наносили на колонку, уравновешенную буфером С, содержащим 0,3 М (NH SO.». Колонку промывали 4-мя объемами вышеуказанного буфера, затем проводили элюцию понижающимся ступенчатым градиентом сульфата аммония. Па первой ступени (10 объемов колонки) концентрация сульфата аммония убывала с 0,3 до 0.015 М, а на второй ступени (7 объемов колонки) концентрация сульфата аммония убывала с 0,015 до 0 М (см.рис.7). Белковый состав фракций анализировали методом SDS-электрофореза в ПААГ. Фракции, содержащие IIsp22, объединяли и концентрировали с помощью ультрафильтрации на мембране NMWL 10000 (МіІІіроге) до конечного объема 3-4 мл. Дальнейшую очистку Hsp22 проводили с помощью гель-хроматографии на колонке Sephacryl S-100 (16/60), уравновешенной буфером Б2. Элюцию проводили при скорости тока 0,6 мл/мин. Собирали фракции объемом 2 мл и анализировали их белковый состав при помощи SDS-электрофореза в ПААГ (рис.8). Фракции, содержащие высоко очищенный Hsp22, объединяли, диализовали против 4 литров буфера БЗ и концентрировали методом ультрафильтрации. Концентрацию Hsp22 определяли спектрофотометрически и по методу Брэдфорд (см пункт 2.8.1.2.). Полученный препарат хранили при -20С.
Данная методика позволяет получить из 1 л культуры E.coli 10-20 мг высоко очищенного Hsp22 как дикого типа, так и К141Е-мутанта 1Ьр22.Препарат рскомбинантного Hsp27 человека и его мутанта с заменами Serl5, 77 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты (ЗО-мутант) был выделен и клеток Е.соІІ по методике, разработанной для выделения рскомбинантного Hsp25 кур [152].
Автор глубоко благодарен младшему научному сотруднику О.В. Букач за любезно предоставленный препарат рекомбинантного Hsp20 человека и его точечного мутанта с заменой Ser 16 на остаток аспарагиновой кислоты (S16D).
Актин скелетных мышц кролика выделяли из ацетонового порошка по методу Парди и Спудича [153]. Препарат ацетонового порошка был любезно предоставлен проф. Д.И. Левицким, Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН. Навеску 0,7 - 1 г порошка заливали 20-кратным объемом буфера А (2 мМ трис-HCl (рН 8,0), 0,2 мМ СаСЬ, 0,2 мМ АТР, 0,5 мМ МЭ, 0,005% азида натрия) и экстрагировали на льду при перемешивании в течение 30 минут, затем центрифугировали 15 минут при 20000g. Осадок повторно экстрагировали 10-кратным объемом буфера А и подвергали центрифугированию. Супернатанты объединяли и фильтровали через складчатый фильтр. Затем инициировали полимеризацию актина добавлением раствора, содержащего 1 М К.С1 и 40 мМ MgCh, до конечных концентраций 50 мМ и 2 мМ соответственно. Полимеризацию проводили в течение 1,5 часов на холоду без перемешивания, чтобы избежать фрагментации актиновых филаментов. К полученному вязкому раствору добавляли сухой К.С1 до конечной концентрации 0,6 М для диссоциации тропомиозина, тропойина и других актин-связывающих белков. Сразу после добавления соли филаменты актина осаждали ультрацентрифугированием при 50000 g в течение 2 часов. Осадок F-актина заливали 4-5 мл буфера А и гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера, после чего диализовали против 2 л буфера А в течение 1-2 суток для деполимеризации актина. Недеполимеризованные филаменты удаляли с помощью ультрацентрифугирования при 50000 g в течение часа. Концентрацию актина определяли спектрофотомстрически (см. пункт 2.8.1.1.). Методика позволяет получить от 10 до 20 мг гомогенного актина из 1 г ацетонового порошка.
Кусочки тканей человека (сердца, скелетных мышц, матки, кишечника, печени, почек, легкого и мозга) помешали в фарфоровую ступку, заливали жидким азотом и растирали пестиком до порошкообразного состояния. Навеску растертой ткани (около 100 мг) заливали однократным буфером для образцов (см пункт 2.8.2.) в соотношении 1 : 10 и кипятили 15 минут. Полученные образцы подвергали SDS-электрофорезу в 12,5% ПААГ с последующим электропереносом на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве белка-стандарта использовали рекомбинантный Hsp22. Иммунную детекцию Hsp22 проводили с использованием моноклональных антител методом ECL (см пункт 2.8.3.).
Разработка метода выделения рекомбинантного Hsp22 человека из E.Coli
Известно, что выделение sHsp из тканей сопряжено с определенными трудностями, обусловленными сравнительно невысоким содержанием этих белков и их способностью взаимодействовать с большим количеством белков-мишеней. Все это препятствует получению больших количеств sHsp и вынуждает в ряде случаев использовать высокие концентрации мочевины и/или детергентов для полной диссоциации комплексов, образованных малыми белками теплового шока и белками-партнерами [2, 95, 141]. Несмотря на то, что в нашей лаборатории был разработан метод выделения тканевого Hsp25 из мускульных желудков кур без использования мочевины или детергентов, оказалось, что эта процедура весьма трудоемка и малоэффективна [2]. Поэтому мы отказались от попыток выделить Н.чр22 из тканей.
В литературе был описан только один метод выделения и экспрессии рекомбинантного Hsp22, содержащего последовательность из нескольких остатков гистидина на N-конце. Использование полигистидиновых последовательностей значительно упрощает процедуру выделения рекомбинантных белков и широко используется на практике. Однако, недавно опубликованные данные свидетельствуют о том, что наличие такой последовательности может приводить к изменению четвертичной структуры малых белков теплового шока [115], поэтому мы решили разработать методику выделения рекомбинантного модифицированного Hsp22 человека без использования каких-либо денатурирующих агентов и без использования полигистидиновых последовательностей или иных генно-инженерных конструкций, облегчающих процедуру выделения белка. В основу метода выделения Hsp22 и К141Е-мутанта были положены подходы, разработанные в нашей лаборатории Букач с соавторами для выделения рекомбинантного Ilsp25 птиц [2] и рекомбинантного !Lsp20 человека [24]. Метод экспрессии белка в клетках E.coli мы оставили почти без изменений, в то время как процедуру выделения и очистки существенно модифицировали.
Основные этапы выделения и очистки Hsp22 представлены на рис. 6. После экстракции белков из E.coli в оригинальной методике [2] предлагалось проводить фракционирование Hsp25 сульфатом аммония в интервале 0-50% насыщения. В этих условиях практически все белки, находящиеся в экстракте, выпадают в осадок. Мы обнаружили, что уже при 30%-ном насыщении сульфатом аммония происходит полное выпадение II.sp22 в осадок. Понизив концентрацию сульфата аммония, нам удалось достичь более эффективной очистки Hsp22 уже на первых стадиях выделения. Следуя ранее опубликованной методике, мы предприняли попытку очистить Hsp22 методом хроматографии на Q-Sepharose. Однако, Hsp22 элюировался очень широким пиком и при этом не удавалось достичь сколько-нибудь заметной очистки Hsp22 от балластных белков. Наши попытки оптимизировать хроматографию на Q-Sepharose, варьируя рН или градиент соли, не увенчались успехом. Поэтому нам пришлось отказаться от аиионообменной хроматографии. Попытки использовать катионообменую хроматографию на S-Sepharose также оказались неудачными. Оказалось, что при кислых значениях рН Hsp22 склонен к денатурации и агрегации, что делало бесперспективным использование катионообменной хроматографии при очистке этого белка. Использование гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose оказалось более продуктивным. В этом случае большая часть примесных белков не сорбировалась на носителе, в то время как Hsp22 прочно сорбировался на гидрофобной матрице и элюировался при понижении ионной силы раствора (см. рис. 7).
Мы обнаружили, что при использовании буферов с нейтральными значениями рП (рН 7.0) происходит существенная протеолитическая деградация Hsp22. При этом теряется около 50% белка, а часть, оставшуюся в интактном состоянии, очень трудно очистить от протеолитических фрагментов. Из данных литературы известно, что I fsp22 подвергается частичному протеолизу при хранении в буфере с рН 7,2 и ниже [34]. Авторы предполагают, что в определенных условиях происходит самопроизвольный гидролиз лабильных пептидных связей Asp-Pro, которые присутствуют в первичной структуре Hsp22. Гидролиз более выражен при кислых значениях рН, однако происходит и во время длительной инкубации при нейтральных значениях рН. Мы обнаружили, что деградацию белка можно существенно снизить путем использования буфера с рН 8,0, поэтому в дальнейшем почти все стадии выделения Hsp22 проводили при этом значении рН.
Завершающей стадией очистки Hsp22 была гель-фильтрация на колонке Sephacryl S-100 (рис. 8). На этом этапе нам удалось получить практически гомогенный препарат Hsp22. Следует отметить, что эффективность очистки зависела от ионной силы буфера элюции. Повышение концентрации NaCl до 150 мМ заметно улучшало разделение пиков белка при проведении гель-фильтрации. Описанный метод позволяет получить 10-20 мг высокоочищенного Hsp22 дикого типа или его К141Е-мутанта из 1 л культуры E.coli. Электрофореграмма конечных препаратов представлена на рис. 9.
К началу наших исследовании экспрессию Hsp22 в различных органах и тканях изучали только путем нозерн-блот гибридизации. Данные о тканевом распределении мРНК Hsp22, опубликованные различными авторами, не всегда совпадали. Поэтому в первую очередь нам представлялось необходимым определить тканевое распределение Hsp22 с использованием моноклональных антител на рекомбинантньтй белок, полученных и любезно предоставленных д.б.н. А.Г. Катрухой.
В нашей работе мы использовали несколько тканей человека. Для получения тканевого экстракта использовали два разных подхода. В первом случае ткань гомогенизированы в смеси ацетона и трихлоруксусной кислоты по ранее описанной методике [152] и после нескольких промываний остаток ткани высушивали в безводном ацетоне, а затем на лиофильной сушке. Полученный сухой остаток суспендировали в 1-кратном буфере для нанесения образцов, используемого в методе Леммли. Полученную суспензию нагревали при 100 С в течение 5 мин и подвергали центрифугированию, после чего использовали супернатант для определения содержания Hsp22. К сожалению, этот метод не обеспечивает эффективной экстракции Hsp22. Видимо поэтому практически во всех исследованных образцах содержание Hsp22 было крайне низким.
Взаимодействие Hsp22 с другими малыми белками теплового шока и возможное участие Hsp22 в регуляции полимеризации актина
Как уже отмечалось в обзоре литературы, некоторые sllsp могут образовывать гетероолигомериые комплексы. На основании ранних работ было высказано предположение, что гетероолигомериые комплексы образуются между малыми белками теплового шока, имеющими сходную первичную структуру. Например, Hsp27 (HspBl) взаимодействует с Hsp20 (HspB6) и аВ-кристаллином (HspB5), а МКВР (HspB2) - только с HspB3 [194]. В последнее время в литературе появились данные, свидетельствующие о возможности образования комплексов Hsp22 с другими малыми белками теплового шока. Удивительно, но партнерами Hsp22 в образовании гетероолигомерных комплексов оказались такие различные между собой белки как cvllsp (HspB7), Hsp27 (HspBl), МКВР (HspB2) [196]. Авторы использовали несколько довольно сложных подходов для изучения взаимодействия Hsp22 с другими sllsp. В исследованиях Бешщорфа и соавт. [12] и Сан и соавт. [196] использовалась дрожжевая дигибридіїая система. При этом в первой работе авторам не удалось обнаружить взаимодействия Hsp22 с Hsp27 дикого типа, а во втором случае такого рода взаимодействие было установлено. В целом же данный метод отличается большим количеством ложноположительных результатов, и полученные с его помощью данные не могут являться достаточным критерием взаимодействия между белками.
Помимо этого Сан и соавт. [196] использовали метод гель-фильтрации, однако постановка эксперимента и интерпретация полученных результатов вызывает определенные сомнения. Экстракт сердечной мышцы был нанесен на колонку, после чего распределение sHsp во фракциях исследовали с помощью антител. Hsp22 присутствовал во фракциях белков с кажущимися молекулярными массами в интервале от 25 до более чем 670 кДа, т.е. практически во всех фракциях, полученных при гель-фильтрации. Неудивительно, что хотя бы в одной части профиля пик Hsp22 совпадал с пиками Hsp27, МКВР (HspB2) и cvHsp (HspB7). Более того, экстракция белков и гель-фильтрация проводились в буферах, не содержащих восстановителей. В этих условиях становится возможным окисление сульфгидрильных групп Hsp22 и образование «сшитых» олигомеров этого белка.
Третий подход, который был использован для анализа взаимодействия IIsp22 с другими малыми белками теплового шока, состоял в коиммунопреципитации рскомбинантных малых белков теплового шока, коэкспрессируемых в клетках 293Т или COS. При этом в клетках экспрессировались малые белки теплового шока, содержащие в своей последовательности специальные дополнительные последовательности - FLAG и Мус, которые позволяли использовать антитела, специфичные к таким последовательностям. Не вызывает сомнения, что включение этих последовательностей может влиять на структуру белка. Кроме того, по данным этих же авторов, N-конец Hsp22, подвергаемый модификации, играет очень важную роль во взаимодействии Hsp22 с МКВР (IIspB2),
Наконец, метод флуоресцентной резонансной миграции энергии, также использовавшийся при исследовании взаимодействия Hsp22 с другими малыми белками теплового шока, предполагает получение химерных белков, в единой поли пептидной цепи которых последовательность, характерная для малого белка теплового шока, слита с последовательностью флуоресцирующего белка. Учитывая тот факт, что размер флуоресцирующих белков сопоставим с размеров малых белков теплового шока, трудно ожидать, что структура полученного конструкта будет абсолютно неотличимой от структуры изолированного модифицированного малого белка теплового шока.
Используя метод гель-фильтрации, мы исследовали прямое взаимодействие между изолированными ( модифицированными Hsp27 и Hsp22, а также между Hsp22 и Hsp20 (см. рис. 20). Ни в одном из экспериментов нам не удалось обнаружить образования стабильных гетсроолигомерных комплексов между Hsp22 и другими малыми белками теплового шока. В этом отношении наши результаты хорошо согласуются с данными Чавез Зобель с соавт. [32], Этими авторами было установлено, что повышенная экспрессия Hsp22 может снижать количество агрегатов мутанта R120G осВ-кристаллина, при этом Hsp22 не образует прочных комплексов с мутированным кристаллином.
Полученные нами отрицательные результаты не означают, что Hsp22 вовсе не способен взаимодействовать с другими малыми белками теплового шока. Нет сомнения, что имеет смысл провести подробное исследование такого рода взаимодействия с использованием иных методов или в иных условиях. В этом отношении следует упомянуть о том, что при рН 6,0 Hsp22 может соосаждаться и даже «зашиваться» дисульфидными связями с Hsp27 (рис. 21 и 22). Мы не беремся утверждать, что такое взаимодействие происходит in vivo и имеет физиологическое значение, однако эти данные демонстрируют, насколько небольшое изменение условий может сказаться на взаимодействии малых белков теплового шока друг с другом.
При исследовании тканевого распределения Hsp22 мы обнаружили, что в наибольших количествах этот белок экспрессируется в различных типах мышц (рис. 10). Данные литературы свидетельствуют о том, что Hsp20, Hsp27 и, возможно, аВ-кристаллин тем или иным способом влияют на структуру и динамику цитоскелета [11, 25, 140, 141, 218]. Учитывая сходство первичных структур Hsp22 и Hsp27 (Hsp20), можно было предположить, что Hsp22 также каким-то образом окажется способным влиять на структуру цитоскелета. Для проверки этого предположения мы исследовали влияние IIsp22 на кинетику и степень полимеризации актина (рис. 19). Оказалось, что Hsp22, будучи добавленным даже в очень большом избытке, не оказывал существенного влияния на процессы полимеризации актина. Таким образом, мы можем исключить вероятность прямого взаимодействия Hsp22 с актином. Этот факт однако не исключает возможности того, что Hsp22 может влиять на полимеризацию актина каким-то опосредованным образом (например, через какие-то до сих пор неизвестные адаптериые белки) или участвует в регуляции других элементов цитоскелета (таких как промежуточные филаменты или микротрубочки).
Предотвращение агрегации частично поврежденных белков является одной из главнейших функций малых белков теплового шока. При этом до последнего времени нет ясного представления о том, каким образом малые белки теплового шока могут предотвращать агрегацию частично денатурированных белков. Как уже отмечалось, мутации в положении, гомологичном Lys 141 Hsp22, характерны для многих малых белков теплового шока и сопровождаются возникновением ряда врожденных заболеваний, таких как катаракта, миопатия, связанная с десмином, болезнь Шарко-Мари-Тута и дистальная наследственная моторная нейропатия второго типа [13]. Оказалось, что мутации R116C аА-кристаллина и R120G аВ-кристаллина, т.е. остатков, гомологичных Lys 141 Hsp22, приводят к заметному уменьшению шаперонной активности сс-кристаллинов [104]. В то же время мутация R148G Hsp27 китайского хомячка (этот остаток также гомологичен Lysl41 Hsp22) не приводит к заметному изменению шаперонной активности этого белка [31]. Таким образом, остается не совсем понятным, связано ли развитие врожденных заболеваний с уменьшением шаперонной активности малых белков теплового шока или с какими-то иными причинами.
