Введение к работе
Актуальность проблемы. В 1974 году Тиссиерес с соавт. [Tissieres et al.,
1974] обнаружили, что в ответ на повышение температуры среды у личинок дрозофилы происходит активация синтеза специфической группы белков, которая получила название белков теплового шока (heat shock proteins, hsp). Позже было установлено, что экспрессия hsp в организмах происходит не только при стрессе, но и в нормальных условиях. В клетках эукариот синтезируется несколько классов hsp, которые различаются по молекулярной массе, структуре и функциям. Эти белки способствуют правильному котрансляционному сворачиванию полипептидных цепей, участвуют в транспорте белковых молекул к местам их назначения, а также в процессах репарации частично денатурированных или элиминации полностью денатурированных белков.
Обширное и гетерогенное семейство малых белков теплового шока (small heat shock proteins, shsp) включает белки с молекулярными массами от 12 до 43 кДа, содержащие в своем составе а-кристаллиновый домен, который состоит из 80-100 аминокислот. Белки этого семейства, препятствуют агрегации денатурированных белков, защищают клетку от теплового и окислительного стрессов, могут участвовать в регуляции апоптоза и, по всей видимости, играют важную роль в функционировании цитоскелета.
Малый белок теплового шока с молекулярной массой 25-27 кДа (hsp25/27) синтезируется практически во всех органах и тканях, при этом в мышцах на его долю приходится до 1-2% растворимых белков клетки [Katoetal., 1992]. В
Список сокращений: АДГ — алкогольдегидрогеназа; ДС-Na - додецнлсульфат
натрия; ПААГ - полиакриламидный гель; ТХУ - трихлоруксусная кислота;
ANS - 1 -анилино-8-нафталин-1 -сульфонат; bis-ANS - 4,4'-дианшшн-1, Г-
динафталин-5,5'-дисульфоки слота; hsp — heat shock proteins (белки теплового
шока); shsp - small hsp (малые белки теплового шока); hsp25 - малый белок
теплового шока птиц с молекулярной массой 25 кДа; Ш мутант — hsp25 с
заменой Serls на остаток Asp; 2D мутант — hsp25 с заменой Ser7g и Sergi на
остатки Asp; 3D мутант — hsp25 с заменой Sei^, Ser^ и Ser^i на остатки Asp.
ответ на различные внеклеточные воздействия hsp25/27 может фосфорилироваться. Считается, что фосфорилирование приводит к диссоциации крупных олигомеров этого белка и сопровождается уменьшением его шаперонной активности [Rogalla et al, 1999]. Постулируется, что hsp25/27 взаимодействует с актином, влияет на полимеризацию актина и участвует в реорганизации цитоскелета при различных неблагоприятных воздействиях [Miron et al, 1988, Miron et al, 1991, Benndorf et al, 1994]. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в исследовании hsp25/27, физико-химические свойства этого белка, механизмы регуляции его шаперонной активности и детали взаимодействия с актином остаются крайне мало изученными. Это, в особенной степени, характерно для hsp25 из тканей птиц, который описан только в двух публикациях [Miron et al, 1988, Miron et al, 1991].
Целью данной работы был анализ структуры и свойств hsp25 птиц и изучение его взаимодействия с актином. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
-
Проанализировать содержание hsp25 в тканях птиц.
-
Исследовать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование, и рН среды на олигомерную структуру, гидрофобные свойства и шаперонную активность hsp25.
-
Исследовать взаимодействие hsp25 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, с нативным и денатурированным актином.
Научная новизна и практическая ценность работы. Определено содержание hsp25 в различных тканях птиц и установлено, что мышцы содержат наибольшее количество hsp25. Установлено, что мутации, имитирующие фосфорилирование, дестабилизируют четвертичную структуру hsp25. Изменение рН в интервале 5,5-7,5 влияет на олигомерную структуру hsp25 дикого типа и его 3D мутанта, имитирующего фосфорилирование hsp25 по остаткам Serl5, 78, 81. Обнаружено, что hsp25 дикого типа и его 3D мутант
способны образовывать гетероолигомерные комплексы, которые более стабильны, чем гомоолигомеры этих белков.
Используя флуоресцентный зонд bis-ANS, установили, что мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на гидрофобные свойства hsp25 и на структурные перестройки hsp25, вызываемые изменением рН. Это может сказываться на-взаимодействии hsp25 с белками-субстратами. Для проверки этого предположения-проведено сопоставление шаперонных свойств hsp25 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, с различными субстратами. Установлено, что, в зависимости от условий инкубации и природы используемого субстрата, мутации, имитирующие фосфорилирование, могут, как повышать, так и понижать шаперонную активность hsp25. Высказано предположение, что шаперонная активность зависит от олигомерного состояния и доступности гидрофобных участков hsp25, а также определяется свойствами комплексов, образуемых hsp25 с белками-субстратами.
Проведено исследование тепловой денатурации G-актина. Установлено, что прогревание при 43С сопровождается незначительными изменениями структуры G-актина, увеличением устойчивости к трипсинолизу и ухудшением способности к полимеризации. Инкубация G-актина при температуре 60С сопровождается появлением гидрофобных участков, формированием высокомолекулярных агрегатов, резким повышением чувствительности к трипсинолизу и полной потерей способности к полимеризации. Обнаружено, что hsp25 незначительно уменьшает скорость полимеризации интактного
актина и эффективно препятствует агрегации денатурированного актина. Высказано предположение, что актин может быть одним из белков-субстратов hsp25 in vivo и, что взаимодействие hsp25 с актином может играть определенную роль в защите клеток от неблагоприятных воздействий.
Полученные данные расширяют и углубляют знания в области структуры и свойств shsp, а также механизма регуляции их шаперонной активности и могут
быть использованы при чтении курса лекций по общей биохимии и биохимии мышц.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на III съезде Биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), на 31-ой конференции Европейского общества по исследованию - мышц (Люнтерен, Нидерланды, 2002), на X международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2003" (Москва, 2003), а также на международной конференции "Биология' молекулярных шаперонов. Механизмы и регуляция шаперонов" (Томар, Португалия, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертация- изложена на 165 страницах и состоит из введения, обзора литературы, методической части, описания результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа содержит 3 таблицы и 37 рисунков. Список литературы включает 322 литературных источника,
