Введение к работе
Актуальность проблемы. Эукариоты, бактерии и археи представляют три высших таксономических группы (домена), которые охватывают все известные формы жизни на Земле Архебактерии были признаны в качестве отдельной филогенетической группы менее, чем 30 лет назад По мере накопления сведений о молекулярной структуре и организации геномов архей стало очевидно, что эта группа организмов обладает структурными, физиологическими, биохимическими и генетическими характеристиками, которые значительно отличают ее от бактерий и эукариот Уникальные особенности архей вызвали направленный интерес к изучению биохимических процессов, протекающих в клетках данных микроорганизмов При этом исследование механизмов протеолитической деградации не является исключением.
Механизмы деструкции белков играют ключевую роль в поддержании сохранности клеточного протеома, обеспечивая удаление нежелательных или опасных белков, а также быструю и адекватную регуляцию биологического ответа на изменяющиеся условия Деградацию белков в клетках бактерий, эукариот и архебактерии осуществляют АТР-зависимые протеиназы, относящиеся к суперсемейству ААА+-белков (АТР-азы с альтернативными активностями)
В последнее время был достигнут значительный прогресс в понимании того, каким образом ААА+-протеиназы узнают свои специфические мишени, осуществляют деградацию белков и разрушение макромолекулярных комплексов Полнее всего механизмы и регуляция АТР-зависимой деградации белков исследованы на примере бактерий и эукариот
В клетках архебактерии к настоящему времени обнаружено две АТР-зависимые протеолитические структуры - цитозольная протеасома и мембраносвязанная Lon-протеиназа К настоящему времени информация о структуре и свойствах этих «протеолитических машин» весьма ограничена Решение проблемы механизма утилизации метаболической энергии на основных этапах АТР-зависимого протеолиза, а также выявление принципов селективного узнавания ферментами из архей субстратов-мишеней и их направленной доставки к протеолитическим центрам представляет актуальную научную задачу
Цели и задачи работы Целью работы явилось структурно-функциональное исследование АТР-зависимой Lon-протеиназы из термофильной архебактерии Archaeoglobus fulgidus (A/Lon). При этом были сформулированы следующие задачи
Разработать методику выделения рекомбинантной A/Lon-протеиназы и исследовать общие энзиматические свойства фермента
Идентифицировать каталитические остатки протеолитического центра A/Lon-протеиназы и выявить групповую принадлежность фермента в классификации пептидгидролаз MEROPS.
Получить и охарактеризовать мутантные, модифицированные и укороченные формы A/Lon-протеиназы с целью выявления особенностей функционирования протеолитических и пептидгидролазных центров, а также для выяснения условий реализации процессивной деградации субстратов
Определить пространственную структуру A/Lon и/или изолированных доменов фермента
Научная новизна и практическая значимость работы Впервые выделена рекомбинантная форма термостабильной A/Lon-протеиназы, принадлежащая к неизученной и малочисленной группе LonB-протеиназ архебактерий Показано, что Lon-протеиназы архей представляют отдельное подсемейство (В) в семействе Lon-протеиназ и отличаются от классических LonA-протеиназ бактерий и эукариот особенностями окружения каталитических остатков пептидгидролазного центра и общей архитектурой молекулы Дана энзиматическая характеристика A/Lon, получены и частично охарактеризованы четыре мутантные формы фермента с заменами аминокислот в области пептидгидролазного активного центра Доказано, что в активном центре LonB-протеиназ функционирует каталитическая диада Ser-Lys Разработаны условия ограниченного протеолиза A/Lon сс-химотрипсином, приводящие к образованию индивидуального протеолитического домена фермента (Р-домен) В совместной работе с лабораторией кристаллографии макромолекул (Национальный институт рака, Фредерик, США) установлена пространственная структура Р-домена A/Lon Показано, что в изолированном виде этот домен находится в неактивной конформации как в растворе, так и в кристалле
Обнаружено, что делеция трансмембранного домена A/Lon-протеиназы приводит к активации протеолитической функции, сопровождающейся автолизом модифицированного фермента в процессе экспрессии т vivo с образованием, аР-фрагмента, включающего а-спирализованный и протеолитический домены A/Lon Образование полноразмерных форм A/Lon, лишенных трансмембранного домена, возможно только при одновременной инактивации протеолитического центра. Сделано заключение о том, что термофильность A/Lon определяется регуляцией активности Р-домена фермента, опосредованной структурой его ААА+-модуля
Показано, что необходимыми факторами реализации процессивного протеолиза служат гидролиз АТР и олигомерность фермента
В целом, представленная работа является первым широкомасштабным исследованием свойств Lon-протеиназы подсемейства LonB Полученные результаты могут быть использованы при дальнейшем изучении закономерностей функционирования АТР-зависимых Lon-протеиназ
Апробация работы и публикаиии Результаты работы бьши представлены на следующих симпозиумах и конференциях. XTV зимняя международная молодежная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), V и VI Симпозиумы «Химия
протеолитических ферментов» (Москва, 2002, 2007), I и П Международные конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004, 2007), VII Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю А Овчинникова, (Москва, 2004), VII Международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (Москва — Суздаль, 2004), VI и VII Международные конференции по ААА-белкам (Сеггау, 2005, Селенчестер, 2007), VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова (Москва - Пущино, 2006), Ш Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Пущино, 2007)
По материалам диссертации опубликовано 16 работ
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 148 страницах, содержит 41 рисунок и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 242 наименования, и приложения, содержащего 7 таблиц и 3 рисунка
