Введение к работе
Актуальность исследования. Многочисленные экспериментальные, клинические и эпидемиологические исследования убедительно свидетельствуют о ключевой роли дислипопротеинемий в патогенезе большого числа социально-значимых заболеваний (ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, ожирение, гипотериоз и др) При сахарном диабете типа 1 и 2 дислипопротеинемий связаны прежде всего с нарушением гормональной регуляции метаболических процессов и являются одним из факторов развития сосудистых осложнений, определяя тяжесть течения заболевания [Manzato Е et al, 1989, Hanefeld М, 1994; Панин ЛЕ, 2000, Деменкова А П., 2001, Яфаеов К.М, Дубянская НВ , 2001; Потеряева О Н и соавт, 2003, Verges В , 2005, Lapolla A et al, 2006] Важнейшим из системных изменений при патологии липидного обмена является нарушение метаболизма липидов мембранных структур [Bryszewska М et al, 1979, Godin D V., Herring F G, 1981, Otsuji S et al, 1981, Kamada T, Otsuji S , 1983, Watala С , Winocour P D , 1992; Falom E , 1999]
Клеточные мембраны являются одним из ключевых звеньев сложной системы обмена липидов в организме Они не только сами содержат липиды как структурный элемент, но и участвуют в переносе последних путем пассивного транспорта и активного рецепторопосредованного эндоцитоза [Титов В Н ,2000; Rigotti A et al, 2003] В самой мембране выделяют липидную фазу, состоящую главным образом из фосфолипидов и холестерина Липидные молекулы, являясь важными структурными и функциональными компонентами клеточной мембраны, регулируют подвижность и активность мембраносвязанных белков, определяя адаптационный потенциал клетки [Крепе Е М, 1982, Геннис Р, 1997, Титов В Н, 2002, Болдырев А А, 2006] Соотношение основных ли-пидных фракций, степень насыщенности жирных кислот, входящих в их состав, определяют такое понятие как «текучесть» липидного бислоя мембраны, влияют на упорядоченность липидных молекул, а также характер липид-липидных и белок-липидных взаимодействий [Владимиров Ю А, Добрецов ГЕ, 1980, Новиков К Н, 2004, Allen H.G, 2006] Возрастание микровязкости липидной фазы плазматических мембран закономерно приводит к снижению активности мембраносвязанных ферментов, торможению связывания рецепторов с лигандами и нарушению других важнейших для клетки процессов [Shmitzky М ,1984, Сомова О Г. и соавт, 1997, Горошинская И А и соавт, 1999, Corver J et al, 2000, DecsiT etal,2002]
Несмотря на очевидную роль обмена мембранных липидов в реализации многочисленных функциональных свойств клеток, в настоящее время нет четких представлений о регуляции этого процесса Выделяют внутриклеточные механизмы регуляции метаболизма липидов плазматической мембраны, которые осуществляются через биосинтетические процессы самой клетки с участием ядра и других органелл [Геннис Р ,1997] Однако важный вклад вносят и
\
другие механизмы регуляции, к которым относятся действие фосфолипаз, вторичных посредников (фосфатидилинозитолтрифосфат, Са2+), система свободно-радикального окисления и тд [Климов АН, Никульчева НГ, 1999, Daleke D L , 2003, Новицкий В В и соавт , 2004]
В мембранах наряду с липидами, прочно связанными с белками цитоскеле-та, существуют формы липидов, которые свободно обмениваются с плазменными липопротеинами В связи с этим изменения состава липидов мембран, в частности клеток крови, могут быть результатом взаимодействия с липопротеинами [Quarford SH, 1970, Faergeman О, Havel RJ, 1975, Poon R, 1981, Hollan S et al, 1995, 1996; Broncel M et al, 2005]
Универсальной моделью плазматических мембран, вполне подходящей для изучения влияния на них внеклеточных воздействий, в том числе и воздействия липопротеинового состава крови, является мембрана эритроцитов Поскольку мембране эритроцитов присущи общие принципы молекулярной организации, выявленные закономерности их функционирования вполне допустимо экстраполировать на плазматические мембраны иных клеток Кроме того, видимая простота организации эритроцита позволяет изучать метаболизм, структуру и функциональные свойства плазматической мембраны без тех помех, которые существуют в клетках с развитыми внутриклеточными мембранными образованиями и органеллами [Постнов Ю В , Орлов С Н ,1987]
Поскольку эритроцитарные мембраны свободно обмениваются с липид-ным компонентом плазменных липопротеинов, использование в качестве модели дислипопротеинемии патологических состояний, в частности сахарного диабета типа 1 и 2 с выраженными нарушениями липопротеинового спектра, может помочь раскрыть механизмы регуляции липидного обмена в клеточных мембранах, а также уточнить роль дислипопротеинемии в изменении качественных и количественных характеристик мембранных липидов Целесообразность проведения такого исследования продиктована тем фактом, что к настоящему времени остается неясной непосредственная роль липопротеинов различных классов и их белкового компонента в метаболизме липидов плазматических мембран и механизмах формирования мембранной патологии при дислипопротеинемиях
Цель исследования' выявить особенности изменений структурно-функциональных характеристик мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях различного типа
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи
1 Выявить особенности структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов у больных с дислипопротеинемиями при сахарном диабете типа 1 и 2
Установить взаимосвязь между нарушениями липидного обмена и структурно-функциональными свойствами липидной фазы мембран эритроцитов у больных с сахарным диабетом типа 1 и 2
Исследовать в эксперименте in vitro влияние липопротеинов различных классов и их белкового компонента (аполипопротеинов A-I, Е и С) на нано-структурные переходы, ответственные за липид-липидные и белок-липидные взаимодействия в эритроцитарных мембранах
Положения, выносимые на защиту:
1 Нарушения липопротеинового обмена более выражены у пациентов с сахарным диабетом типа 2 по сравнению с таковыми у больных сахарным диабетом типа 1 и характеризуются значительным увеличением содержания в крови липопротеинов очень низкой плотности, триглицеридов и общего холестерина
2. Структурно-функциональные изменения эритроцитарных мембран при сахарном диабете развиваются как часть общих системных нарушений липидного обмена, одним из ключевых звеньев которых является развитие дисли-попротеинемий
Изменения структурных и функциональных свойств мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях, сопровождающих сахарный диабет типа 1 и 2, характеризуются структурной перестройкой мембранных липидов, нарушением их микровязкостных свойств и уменьшением активности мембранос-вязанной Ыа+,К+-АТФазы
В механизмах действия липопротеинов на клеточные мембраны важную роль играет не только липидный, но и белковый компонент аполипопроте-ин A-I снижает микровязкость липидной фазы и изменяет характер белок-липидных взаимодействий, аполипопротеины С вызывают противоположное действие - повышают микровязкость липидного бислоя и нарушают бе-лок-липидные взаимодействия, аполипопротеин Е не оказывает мембрано-тропного эффекта
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование изменений структурно-функциональных свойств мембран эритроцитов с учетом особенностей нарушений липопротеинового спектра крови у больных сахарным диабетом типа 1 и 2 Показано, что липидный состав и микровязкостные свойства мембран эритроцитов существенно нарушаются при увеличении соотношения в сыворотке атерогенных и антиатерогенных фракций липопротеинов Установлено, что выраженность нарушений липидного обмена у пациентов влияет на степень дезорганизации плазматических мембран Рассмотрен вопрос о прямом воздействии как липопротеинов, так и аполипопротеинов на биофизические свойства плазматических мембран Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о различном влиянии аполипопротеинов на эритроцитарные мембраны крыс выраженное снижение микровязкости при
действии аполипопротена A-I, увеличение ее при действии аполипопротеина С и отсутствие изменений при действии аполипопротеина Е.
Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенного исследования получены новые данные фундаментального характера о состоянии мембран эритроцитов при дислипопротеинемиях у больных сахарным диабетом типа 1 и 2 Выявленные закономерности позволяют говорить о связи структурных изменений клеточных мембран с их биофизическими характеристиками (микровязкость, липид-липидные и белок-липидные взаимодействия) и активностью мембраносвязанных ферментов (Na ,К+-АТФаза) Они также свидетельствуют о важной роли межсистемных взаимодействий клеточные мембраны и липопротеины сыворотки крови, как функционально активная среда, в которой существуют и работают эти мембраны Установленные нами закономерности указывают на необходимость разработки новых подходов к мембра-нотропной терапии для коррекции системных нарушений при дислипопротеинемиях
Апробация и внедрение результатов работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на VI международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005), на научно-практической межрегиональной конференции, посвященной 70-летию ГОУ ВПО НГМА Росздрава «Актуальные проблемы современной эндокринологии» (Новосибирск, 2005), XI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2006)
Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ по проблемам «Молекулярные основы нарушений структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051 2003 4), «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153 2006 7)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 - в центральных рецензируемых журналах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования), выводов и списка литературы, включающего 258 источников, из них - 78 отечественных и 180 зарубежных авторов Работа иллюстрирована 34 таблицами и 7 рисунками