Введение к работе
Актуальность темы
Поверхностные белки наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий играют заметную роль в патогенезе инфекции: способствуют адгезии (и, возможно, инвазии) бактерий, влияют на характер иммунного ответа, обеспечивая устойчивость к фагоцитозу. Кроме того, они взаимодействуют с системой связывания комплемента и ингибируют продукцию лимфоцитов.
Неослабевающий интерес к этим белкам объясняются целым рядом их иммунологических особенностей. Во-первых, такие белки, как правило, характерны для данного рода или вида микроорганизма, т.е. являются иммунологическими маркерами. Во-вторых, они относятся к высокоиммуногенным компонентам микробных клеток, и определение антител к ним используется при диагностике инфекционных заболеваний. Кроме того, многие из поверхностных белков оказывают ярко выраженное протектовное действие и поэтому могут служить основой при конструировании вакцинных препаратов.
Порины принадлежат к доминирующим в количественном отношении компонентам НМ и осуществляют жизненно важную функцию для микробной клетки. В нативной мембране они существуют в олигомерной форме, чаще всего в виде тримеров, которые образуют трансмембранные каналы для диффузии ниэкомолекулярных соединений, как питательных веществ, так и продуктов жизнедеятельности клетки. По своим физико-химическим свойствам порины представляют собой р-структурированные слабокислые белки, которые, в отличие от обычных интегральных белков, содержат значительное количество гидрофильных аминокислот.
В растворах изолированные порины могут существовать только в присутствии детергентов. При этом, благодаря высокой структурной пластичности молекулы, они могут образовывать различные конформационные интермедиаты. В литературе имеются ограниченные сведения об условиях образования, пространственной структуре и стабильности этих молекулярных форм белка. Тем не менее, получен целый ряд экспериментальных доказательств, свидетельствующих о том, что изменение конформации поринов приводит к изменению биологической активности этих белков.
Основной порообразующий белок НИ/1 Yersinia pseudotuberculosis, микроба, вызывающего заболевание лсевдотуберкулезом, обладает всеми вышеуказанными биологическими свойствами поверхностных антигенов бактериальной клетки. Выяснение взаимосвязи между пространственной структурой данного белка и его иммунобиологической активностью расширит представление о различных свойствах молекулярных форм поринов и позволит правильно оценить возможности практического использования этих белков в качестве диагностических антигенов и компонентов химических вакцин.
Иерсиниозы и, в частности, псевдотуберкулеэ, имеют большой удельный вес в инфекционной патологии человека. Доля псевдотуберклеза (или по международной классификации болезней - 10, экстраинтестинального
иерсиниоза) в инфекционной патологии населения нашей страны, и Дальневосточного региона в частности, в последние годы заметно увеличилась. При этом многообразие клинических форм, часто маскирующих псевдотуберкулеэ под другие заболевания (даже неинфекционной этиологии), осложняет его диагностику. Кроме того, она затруднена и за счет современных эпидемиологических особенностей возбудителя: в последние годы заболевание чаще всего протекает в виде спорадических случаев, а не носит характер эпидемических вспышек, регистрировавшихся ранее. Следует особо подчеркнуть, что большая часть болеющих псевдотуберкулезом - дети в возрасте до 14 лет. Они составляют более 65% от общего числа заболевших.
В этих условиях увеличивается значимость лабораторных методов верификации псевдотуберкулеза, что, в свою очередь, определяет устойчивое внимание исследователей к разработке новых иммунохимических методов лабораторной диагностики данного заболевания.
Цель и задачи исследования
Цель работы заключалась в изучении иммунобиологических свойств основного порообразующего белка из НМ псевдотуберкулезного микроба (иерсинина) и, на основе полученных результатов, выбора максимально эффективной молекулярной формы данного антигена для целей иммунодиагностики и вакцинопрофилакгики.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
выделить и охарактеризовать физико-химические свойства различных молекулярных форм порина;
сравнить антигенную структуру, иммуногенные и протективные свойства стабильных информационных интермедиатов иерсинина;
сконструировать высокоэффективную диагностическую тест-систему на основе порина для дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза.
Научная новизна
Впервые проведено сравнительное исследование иммунобиологических свойств различных молекулярных форм основного порообразующего белка НМ Yersinia pseudotuberculosis. Установлено, что порин является видо- и родоспецифическим антигеном рода Yersinia. Продемонстрирована высокая иммуногенная и протективная активность термоденатурированной мономерной формы порина по сравнению с олигомерами белка, представляющими собой частично развернутые молекулы с нестабильной третичной структурой. На основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) при использовании в качестве антигена термоденатурированного мономера разработана эффективная диагностическая тест-система, позволяющая достоверно идентифицировать псевдотуберкупез на ранних стадиях развития инфекции.
Теоретическая значимость работы
Полученные данные вносят вклад в изучение взаимосвязи между структурой и биологической активностью одного из интегральных мембранных белков грамотрнцательных бактерий, а также в исследование роли поринов на ранних стадиях развития инфекции и в инициировании клеточных и
гуморальных защитных механизмов макроорганизма. Практическая значимость работы
Разработана новая видоспецифическая иммуноферментная тест-система для определения антител в сыворотках крови больных с использованием в качестве антигена термоденатурированного мономера порина, наиболее стабильной по своим физико-химическим характеристикам и эффективной для защиты животных от экспериментальной инфекции молекулярной формы белка.
На способ диагностики псевдотуберкулеза Российским агенством по патентам и товарным знакам выдан патент на изобретение «Способ диагностики псевдотуберкулеза» №2153172. По материалам разработки оформлены Методические указания МУ 3.1.1.001-98 «Определение антител в сыворотках людей методом ИФА для диагностики псевдотуберкулеза», предназначенные для сотрудников диагностических, иммунологических и биохимических лабораторий, врачей инфекционистов общей поликлинической и лечебной сети. Данные методические указания утверждены решением комиссии по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Центре Госсанэпиднадзора в Приморском крае от 28.06.98. и разрешены к применению на территории Приморского края.
Разработан новый метод получения данного антигена, пригодный для наработки препарата порина в условиях опытного производства.
Основные положения работы доложены на:
2-ой Всесоюзной научно-практической конференции «Иерсиниозы», Владивосток, 1989 г;
5-th International Symposium on Yersinia, Japan, 1990;
9-th European Symposium on animal, plant and microbial toxins, Tallinn, 1990;
8-th Conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry, Riga, 1991;
3-th German-Russian Work-shop on Biotechnology, Berlin, 1994;
5-ом Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике, Москва, 1995;
6-ом Русско-Японском медицинском симпозиуме, Хабаровск, 1998;
19-th Pacific Science Congress, Sidney, 1999.
Материалы диссертации изложены в 6 научных статьях, патенте на изобретение и 9-ти тезисах докладов на российских и международных конференциях.
Объем и структура диссертации
Похожие диссертации на Иммунобиологические свойства порообразующего белка из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis
