Введение к работе
Актуальнооть проблемы.
Повышенный интерес в последние годы вызывает возможность использования молекулярных подходов в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза. Нарушение процесса гемостаза может привести о одной стороны к избыточным кровотечениям и геморрагиям, с другой стороны к тромбозам.
К настоящему времени считается доказанным, что повышенная способность тромбоцитов к агрегации, определяет патогенез тромбоза при развитии атеросклероза, иявмииолиг Л"»^з: "ГЛ:"- « і»—і»й. пиййй-гкческкх ангиопнтиях.
В соответствии с современными представлениями, агрегационная способность тромбоцитов находится под контролем систем циклических 3',5'-аденозинмонофосфата (цАШ) и 3',5'-гуанозингюнофосфата (цГМФ). Установлено, что тромбоцитарная система цАМФ опосредует внешний сигнал к ограничению агрегации: воздействие на здекилатцкк-лазу простацикликом, простагландином Еі и другими первичными мео-сенджерами приводит к подавлению агрегации тромбоцитов (Гаврилов, 1981; Jaschonek, 1988).
О тромбоцитарной системе цГШ и ее ключевом ферменте гуанилат-циклазе (ГЦ) известно значительно меньше. В последние годы идут интенсивные исследования, определяющие роль цГШ> в агрегации тромбоцитов. Ранее считалось, что цГШ опосредует инициацию агрегации (Golberg, 1975, 1977), исследования последних лет позволили предположить, что система цГМФ осуществляет негативный контроль агрегации тромбоцитов (Matsuoka, 1983; Mellion et al., 1981). При этом допускается, что сам процесс агрегации тромбоцитов может стимулировать систему цГШ, регуляторное действие которой осуществляется по принципу "отрицательной обратной связи". Имеющийся к настоящему времени экспериментальный материал в пользу такого предположения основан главным образом на двух группах фактов:
-
активаторы ГЦ, повышающие содержание цГШ в тромбоцитах, проявляют антиагрегационное действие (Matsuoka, 1985; Waldman, 1989)j
-
при агрегации наблюдается повышение цГШ в тромбоцитах (Haslam, 1974,1975,1978).
То, что тромбоцитарная система цТШ может вовлекаться в регуляцию процесса агрегации, обусловило в последнее время повышенный интерес к ГЦ - ферменту биосинтеза цТШ в клетке. При этом в литературе отсутствуют сведения о влиянии агрегации на активность ГЦ и ее регуляцию, нет стройной системы доказательств роли цГМЗ? в регу-
ляции процесса агрегации.
Изучение свойств ГЦ, особенностей 'функционирования тромбоци-тарной системы цГМФ, ее роли в агрегации/дезагрегации тромбоцитов представляются весьма перспективными как для понимания причин" нарушений^ возникающих в этих процессах, так и для разработки' путей воздействия на ГЦ с целью их нормализации.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования явилось выявление взаимосвязи функционирования тромбоцитарной ГЦ с процессом агрегации тромбоцитов. В связи с этим представлялось необходимым решить следующие задачи:
-
Разработать метод изучения активности ГЦ при обратимой и необратимой фазах агрегации для сравнительной оценки функционирования гуанидатцикдазы при этих двух процессах.
-
Исследование активности ГЦ и ее способность к активации в присутствии нитропруссида натрия, протопорфирина IX, арахидоновой кислоты и L-аргинина в динамике агрегационного процесса, что позволит оценить изменения регуляции активности гуашлатциклазы при агрегации тромбоцитов.
-
Изучить роль цГШ в регуляции агрегационного процесса. Исследовать его влияние на обратимой и необратимой фазах агрегации.
-
Выяснить возможный механизм регуляции агрегации тромбоцитов циклическим ГМФ.
-
Разработать новые подходы нормализации повышенной агрегаци-онной способности тромбоцитов на основе изучения функционирования ГЦ во время агрегации тромбоцитов.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые описано изменение функционирования ГЦ в процессе АДФ(аденозин-5'-дифосфорная кислота)-индуцированной агрегации тромбоцитов человека: снижение базальной активности, увеличение способности фермента к активации соединениями стимулирующими активность как по гем-зависимому механизму (нитропруссид натрия, L-аргинин), так и по гем-независимому механизму (протопорфирин IX, арахидоновая кислота) с одновременным увеличением содержания цГШ в тромбоцитах.
Впервые показано, что одним из механизмов повышения стимулиру-емости ГЦ при АДФ-индуцированной агрегации является увеличение насыщенности фермента гемом.
Исследована роль цГШ в регуляции процесса агрегации. Показано і что цГШ участвует в инициации процессов дезагрегации, т.е. регуляция осуществляется по принципу "отрицательной обратной связи",
что позволяет направленно воздействовать на активность ГЦ с целью коррекции агрегационного процесса.
Установлено, что молекулярным механизмом регуляции процесса агрегации ГЦ системой является ингибирование высвобождения выутрит-ромбоцитзрного кальция, необходимого для развития агрегации.
Исследовано и объяснено антиагрегационное действие М-(6-амшо-гексил)-5-хдорнафталин-1-сульфамида (W-7) и его аналогов. Показано, что эти соединения в достаточно низких концентрациях (Ю-'' - ю-6 М) активіфовали тромбоцитарную ГЦ и ингибировали агрегацию тромбоцитов. Интенсивность янтиагрегационного дбй^тіі-і Сш^ь. црииомцик-нальна эффективности стимулируйн-го влияния.
Исследован механизм антиагрегационного действия производных 1,2-диазетидин-1,2-ди-Н-оксида - нового класса отечественных соединении, генерирующих оксид азота. Показано, что используемые соединения стимулировали ГЦ, ингибировали агрегацию тромбоцитов и обладали сильным дегагрегационным действием. Установлено, что в основе проявления антиагрегационных и дезагрегационных свойств исследуемых соединений лежит N0-зависимый механизм активации ГЦ и увеличения уровня цГШ в тромбоцитах.
Полученные результаты открывают возможность для разработки новых подходов к поиску и созданию эффективных антиагрегационных препаратов на основе изучения механизма направленной активации ГЦ.
Апробация работы состоялась на совместной научной конференции лаборатории энзимологии экстремальных состояний, лаборатории биохимии и патохимии углеводного обмена и лаборатории физиологически активных пептидов и гуанилатциклаэной системы 1 декабря 1994 года.
Материалы диссертационной работы были доложены на V Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимологии (Махачкала, 1986), на Всесоюзном симпозиуме "Проблемы клинической энзимологии" (Ужгород, 1989), I-Всесоюзной школе-семинаре "Тромбоцит как тест система физиологических и патологических состояний организма" (Москва, 1990), и на 39-Annual Scientific Meeting1 of The Cardiac Society of Australia and New zeland (Перт, Австралия, 1991).
По теме диссертации имеется 12 публикаций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, в котором рассмотрены общие представления о физиологии и биохимии процесса агрегации, основы регуляторной деятельности системой цГШ, ее возможная роль в агрегации тромбоцитов, свойства ГЦ и механизмы регуляции ее активности; материалов и методов исследования; экспериментальной части; обсуждения полученных
