Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
I. Общие представления о регуляции сократительной
активности 10
1. Роль мембранных структур в регуляции мышечного сокращения Ю
2. Тонкая структура сократительного аппарата 12
3. Две системы регуляции сокращения мышцы на уровне сократительных белков J7
а) Миозиновый тип регуляции 27
б) Актиновый тип регуляции. 19
П. Роль тропонин-тропомиозинового комплекса в регуляции сокращения скелетных мышц и сердца 21
1. Структура, свойства тропомиозина 21
2. Общая характеристика тропонина скелетных мышц и сердца 25
а) тропонин С 26
б) тропонин 1 38
в) тропонин Т 43
3. Особенности взаимодействия белков тонкого филамен та скелетных мышц и сердца 47
4. Гипотетические механизмы функционирования тропонин-тропомиозинового комплекса 50
5. Фосфорилирование как возможный механизм тонкой регуляции активности тропонин-тропомиозинового комплекса 55
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ - З стр.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 58
I. Выделение белков и пептидов. Исследование взаимодействия изолированных компонентов тропонина друг с другом 58
1. Выделение тропонина 58
2. Разделение тропонина на компоненты 59
а) Ионообменная хроматография полного тропонина 59
б) Очистка тропонина С на "голубой"сефарозе 62
3. Расщепление тропонина С по остаткам цистеина и выделение пептидов тропонина С 62
4. Исследование взаимодействия С-концевого пептида тропонина С с тропонином I и тропонином Т методом электрофореза 69
5. Исследование взаимодействия тропонина С с тропонином Т методом гель-фильтрации и электрофореза... 69
П. Спектральные методы исследования 70
1. Исследование реакционной способности SH-групп тропонина с помощью НБД-хлорида 70
2. Использование флуоресцентной спектроскопии для изучения катион-связывающих свойств полного тропонина, тропонина С и С-концевого пептида тропонина С сердца. "71
а) Изучение катион-связывающих свойств полного тропонина с использованием гидрофобного зонда диметила минонафтэйродина 71
б) Исследование параметров связывания двухвалентных катионов с тропонином С и его С-концевым пептидом по величине собственной белковой флуоресценции... - 4 стр.
3. Изучение катион-связывающих свойств тропонина С и его пептидов методом кругового дихроизма 74
Ш. Некоторые аналитические методы 75
1. Использование хелаторов для поддержания постоянной концентрации двухвалентных катионов в среде 75
2. Электрофорез белков и пептидов в полиакриламидном геле 76
а) Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия.. 76
б) Исследование связывания Са с белками и пептидами 76
3. Определение концентрации белка и пептидов 77
4. Аминокислотный состав пептидов 77
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 78
I. Выделение тропонина и его компонентов из сердца быка.. 78
П. Изучение катион-связывающих свойств тропонина сердца.. 83
1. Использование гидрофобного зонда диметиламинонафтей-родина для обнаружения конформационных изменений тропонина, вызываемых связыванием Са по Са -специфическим центрам 83
2. Локализация и свойства катион-связывающих участков тропонина С сердца 89
а) Химическое расщепление тропонина С по остаткам цис теина и выделение пептидов 89
б) Использование собственной белковой флуоресценции для изучения катион-связывающих свойств тропонина С и его С-концевого пептида 93
в) Исследование катион-связывающих свойств тропонина С и его педтидов методом кругового дихроизма 99
г) Изучение Са -связывающих свойств тропонина С и его С-концевого пептида методом электрофореза 105
. Ш. Исследование взаимодействия компонентов тропонина сердца НО
1. Взаимодействие С-концевого пептида тропонина С с тропонином I и тропонином Т НО
2. Сравнительное изучение взаимодействия тропонина С и тропонина Т сердца и скелетных мышц II6
а) Использование метода гель-фильтрации для исследования взаимодействия тропонина С и тропонина Т 116
б) Изучение взаимодействия тропонина С и тропонина Т методом электрофореза в полиакриламидном геле... 118
3. Роль Са + и SH-групп в регуляции взаимодействия компонентов тропонина сердца 120
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 128
I. Сравнение катион-связывающих свойств тропонина сердца и скелетных мышц 128
1. Диметиламинонафтэйродин-флуоресцентный зонд, по-зволяющий исследовать Са " "-специфические участки тропонина сердца и скелетных мышц 128
2. Локализация и свойства катион-связывающих участков тропонина С сердца 131
П. Белок-белковое взаимодействие в полном тропонине
сердца 139
1. Взаимодействие тропонина I и тропонина Т с С-конце вым пептидом тропонина С 139
2. Особенности взаимодействия тропонина С и тропонина Т сердца и скелетных мышц 140
3. Участие Са + и SH -групп в поддержании целостности тропонина сердца 142
ВЫВОДЫ І46
СПИСОК ЖТЕРАТУРЫ 1
Введение к работе
Сокращение мышцы, в основе которого лежит взаимодействие актина с миозином, регулируется ионами Са . В сердце и скелет _ 2+ ных мышцах позвоночных рецепция Са и регуляция сокращения осуществляется тропонин-тропомиозиновым комплексом. Тропонин состоит из 3-х белковых компонентов: тропонина С - компонента, связывающего Са2+, тропонина I - компонента, обеспечивающего ингибирование взаимодействия актина с миозином, и тропонина Т -компонента, взаимодействующего с тропомиозином. Первичная структура и многие свойства компонентов тропонина скелетных мышц изучены достаточно подробно. Компоненты тропонина сердца изучены в значительно меньшей степени. Так, например, в настоящее время известны первичная структура тропонина С /311/ и тропонина I /100/, однако, первичная структура тропонина Т сердца не определена. До настоящего времени дискутировался вопрос о количестве и свойствах Са "-связывающих участков тропонина сердца. Нерешенным является вопрос об участии Са -специфического участка тропонина С сердца в регуляции сокращения, а также о том, способен ли связавшийся с этим участком Са + изменять структуру полного тропонина сердца.
Несмотря на значительную гомологию компонентов тропонина, выделенных из 2-х типов мышц, тонкие механизмы регуляции сокращения сердца отличаются от таковых скелетных мышц /230, 255/. Согласно современным представлениям связывание Са с тропони-ном С вызывает конформационные изменения тропонин-тропомиозино-вого комплекса, которые каким-то образом передаются на тонкий филамент и способствуют взаимодействию актина с миозином. Необходимым условием понимания механизмов регуляции сокращения сердца является знание структуры и свойств компонентов тропонина, а также детальное описание взаимодействия отдельных компонентов тропонина друг с другом и белками сократительного аппарата в зависимости от концентрации Са .
Цель настоящей работы состояла в изучении Са -связывающих свойств полного тропонина и тропонина С сердца, а также в исследовании взаимодействия компонентов тропонина сердца. В задачи исследования входило: обнаружение Са +-специфических конформаци онных изменений полного тропонина сердца; получение пептидов тропонина С сердца, содержащих Са -связывающие участки, и характеристика катион-связывающих свойств этих участков ; изучение взаимодействия компонентов тропонина сердца друг с другом.
В настоящей работе предложена модификация метода выделения тропонина из сердца крупного рогатого скота. Разработанный метод позволяет получить с высоким выходом высокоочищенные препараты тропонина. Впервые получены пептиды тропонина С сердца, содержа р щие Са -связывающие участки. Изучены катион-связывающие свойства тропонина С и его пептидов. Выделение пептидов тропонина С открывает новые возможности не только для изучения катион-свя-зывающих свойств Са -связывающих участков тропонина С сердца, но и для более детального исследования белок-белкового взаимодействия в полном тропонине сердца. Результаты, полученные в данной работе, расширяют представления о структуре и свойствах тропонина сердца.
