Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы
1.1. Физиолого-биохимические аспекты гетерозиса 10
1.2. Структурно-функциональные свойства альбумина сыворотки крови 15
1.2.1. Структура и физико-химические свойства альбумина. 16
1.2.2. Функциональная изменчивость структуры и свойств альбумина сыворотки крови 26
1.2.3. Эволюционно-генетические предпосылки изменчивости сывороточного альбумина 31
Глава 2 Экспериментальная часть
1.1. Материалы исследований 38
1.2. Методы анализа физико-химических свойств альбумина. 41
1.2.1. Определение молекулярной массы фильтрацией в тонком слое сефадекса 41
1.2.2. Гель-фильтрация в сефадексе 44
1.2.3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе 44
1.2.4. Переосаждение альбумина в системе трихлорук-сусная кислота - этанол 45
1.2.5. Изоэлектрическое фокусирование 46
1.2.6. Обезжиривание и температурная обработка белка . 50
1.3. Методы анализа структуры альбумина 51
1.3.1. Определение аминокислотного состава (метод хроматографии на бумаге) 51
1.3.2. Исследование пептидного состава триптических гидролизатов (метод пептидных карт) 53
1.3.3. Инфракрасная спектроскопия 57
1.3.4. Дисперсия оптического вращения 58
2.1. Характеристика гомогенности препаратов альбуми на сыворотки крови 60
2.1.1. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе... 61
2.1.2. Гель-фильтрация 63
2.1.3. Дереосаждение в системе трихлоруксусная кислота - этанол 65
2.2. Физико-химические свойства сывороточного альбумина 66
2.2.1. Молекулярная масса 66
2.2.2. Изоэлектрические свойства нативного сывороточного альбумина 68
2.2.3. Изоэлектрическая характеристика сывороточного альбумина, обработанного теплом 74
2.2.4. Влияние тепловой обработки на обезжиренный альбумин 84
2.3. Структура альбумина сыворотки крови кур 94
2.3.1. Аминокислотный состав сывороточного альбумина... 95
2.3.2. Пептидный состав сывороточного альбумина 106
2.3.3. Структура альбумина по данным инфракрасной спектроскопии и дисперсии оптического вращения 112
Литература 139
- Физиолого-биохимические аспекты гетерозиса
- Функциональная изменчивость структуры и свойств альбумина сыворотки крови
- Определение молекулярной массы фильтрацией в тонком слое сефадекса
- Исследование пептидного состава триптических гидролизатов (метод пептидных карт)
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших общебиологических проблем, имеющих теоретическое и практическое значение, является проблема гетерозиса. С успешным ее решением тесно связано повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и растений, так как в современном сельском хозяйстве все шире используются гетерозис-ные гибриды, превосходящие исходные родительские формы по продуктивности, плодовитости, менее подверженные заболеваниям и требующие меньших затрат на их производство /69,79,80,83/.
Несмотря на широкое применение эффекта гетерозиса в народном хозяйстве, до настоящего времени нет единого мнения относительно природы этого явления, что существенно затрудняет его практическое применение. Успешное решение проблемы гетерозиса, как одного из методов прогрессивной селекции, невозможно без использования новейших достижений генетики, биохимии, иммунологии и других биологических наук, что и было подчеркнуто в принятом в 1981 г. постановлении ЦК КПСС и Совета министров СССР "0 дальнейшем развитии физико-химической биологии и биотехнологии и использования их достижений в медицине, сельском хозяйстве и промышленности" /I /.
В настоящее время широкое распространение получает физиолого-биохимический подход к изучению явления гетерозиса, в особенности в птицеводстве, где применение гетерозисних гибридов имеет высокую экономическую эффективность /78,80,83,84/.
Эффект гетерозиса наблюдается уже на ранних стадиях эмбрионального развития /37,82/ и затем в постнатальном периоде проявляется в виде повышенной активности гормонов /37,69/, тканевых ферментов /45,111/, пищеварительных ферментов /111,30/, в интенсификации биосинтеза белков /19,76,13/. В соответствии с этим особую роль играет кровь и отдельные ее компоненты, определяющие гомеостаз. В частности, рядом исследователей показаны специфические изменения в белковом составе сыворотки крови и структурно-функциональных свойствах некоторых белков крови гетерозисных гибридов /97,63,103,23/. Установлена также корреляция между генетическим типом некоторых сывороточных белков и продуктивными качествами гибридов /112,32/. Однако структура и функциональная активность отдельных белков сыворотки крови в условиях гетерозиса изучена недостаточно. В связи с этим представляет интерес изучение сывороточного альбумина,как одного из белков крови, структура и физико-химические свойства которого взаимосвязаны с выполняемой им функцией транспорта метаболитов различной природы. Эта функция в условиях гетерозисного организма приобретает особое значение, так как в случае положительного гетерозиса все обменные процессы протекают более интенсивно. Ранее было показана возможность изменения структуры сывороточного альбумина у домашней птицы /171/, а также повышенная способность альбумина гетерозисных гибридов связывать липидные лиганды /23/. Поэтому изучение структуры и физико-химических свойств сывороточного альбумина у гетерозисных гибридов кур может быть использовано при раскрытии механизмов эффекта гетерозиса, а также может способствовать выявлению и использованию специфических свойств активно функционирующего белка крови в качестве биохимических маркеров при прогнозировании положительного соматического гетерозиса у кур мясного направления.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы заключается в установлении специфических особенностей структуры и физико-химических свойств альбумина сыворотки крови у гибридных цыплят с явными признаками гетерозиса. В конкретную задачу входило сравнительное изучение у гетерозисных гибридов и исходных родительских пород таких биохимических характеристик сывороточного альбумина, как молекулярная масса, изоэлектрические свойства нативного и модифицированного альбумина, определение содержания отдельных аминокислот в кислотных гидролизатах белка и пептидов в ферментативных гидролизатах, а также исследование пространственной структуры альбумина. Работа в указанном направлении представляется це- 1 лесообразной в соответствии с необходимостью дальнейшего раскрьн тия механизмов реализации генетической информации в гибридных организмах на основе проявления специфичности некоторых феноти- ( пических признаков.
Новизна полученных результатов. Установлен индивидуальный характер микрогетерогенности сывороточного альбумина у цыплят и взрослых кур отцовской и материнской пород и у их гетерозисных гибридных цыплят. С помощью изоэлектрического фокусирования у гибридов,по сравнению с исходными формами,выявлено достоверно большее смещение в менее кислую область изоэлектрической точки препарата альбумина (главный компонент изоэлектрического спектра) после обезжиривания белка, что может отражать повышенную способность альбумина гибридов связывать жирные кислоты и другие ли-пидные метаболиты в условиях активизации обменных процессов в гетерозисном организме.
Впервые обнаружена повышенная устойчивость сывороточного альбумина у гибридных гетерозисных цыплят к денатурирующему действию температуры, что может быть объяснено как особенностями структуры молекулы альбумина гибридов, так и повышенной способностью этого белка связывать метаболиты липидной природы.
Определена молекулярная масса альбумина кур. Найдены различия в количественном содержании отдельных аминокислот альбумина, а также пептидного состава триптических гидролизатов этого белка у гетерозисных гибридов и у кур родительских пород, что может отражать фенотипическую принадлежность гомологичного белка сравниваемых групп птиц.
С помощью методов инфракрасной спектроскопии и дисперсии оптического вращения впервые показаны особенности пространственной структуры сывороточного альбумина у гибридных цыплят с явными признаками гетерозиса.
Теоретическое и практическое значение. Полученные данные содержат дополнительную информацию о проявлении эффекта гетерозиса на молекулярном уровне. Выявленные у гетерозисных гибридов кур индивидуальные особенности структуры и физико-химических свойств альбумина сыворотки крови могут быть использованы как биохимические показатели при раскрытии механизмов эффекта гетерозиса.
Практическое значение работы заключается в том, что установленная методом изоэлектрического фокусирования термоустойчивость альбумина сыворотки крови гибридов может быть использована в качестве биохимической характеристики при оценке продуктивности мясных гибридных цыплят. Обнаруженные различия в значениях изо-электрических точек и термоустойчивости сывороточного альбумина отцовской и материнской пород кур могут быть применены в качестве биохимических маркеров при подборе родительских пар с целью прогнозирования высокопродуктивных гибридных форм в мясном птицеводстве.
Апробация работы. Материалы исследований доложены на ежегодных итоговых конференциях профессорско-преподавательского состава Симферопольского государственного университета им. М.В.Фрунзе (1975-1978 г.г.), на Ш и ІУ Всесоюзных биохимических съездах (Рига, 1974г.; Лёнинград,1979г.), на Ш Украинском биохимическом съез 9 де (Донецк, 1977), на заседании научно-технического Совета Крымского отделения Украинского НИИ птицеводства (Симферополь,1979г.), на Республиканском симпозиуме "Молекулярно-генетические основы гетерозиса" (Симферополь, 1980 г.), на заседании Крымского отделения Всесоюзного биохимического общества (Симферополь, 1982 г.).
Физиолого-биохимические аспекты гетерозиса
Все многообразие функций организма, структура его отдельных органов, тканей, молекул являются материальным воплощением наследственной информации. В равных условиях существования преимущества находятся на стороне тех индивидуумов, которые обладают генетическим фондом, обеспечивающим им широкую амплитуду приспособительных реакций к изменениям окружающей среды. К таким генетически обогащенным особям относятся, в первую очередь, гетерозиготи.
Особое место среди гетерозигот занимают особи, характеризующиеся большей или меньшей степенью выраженности какого-либо признака в сравнении с родительскими формами /126/. Эти качества, как правило, наиболее ярко проявляются у гетерозиготных потомков первого поколения, получивших название гетерозисных гибридов.
Явление гетерозиса имеет место в природных популяциях, но в общей массе оно малочисленно /54/. В сельском хозяйстве в условиях искусственного разведения широко используются методы получения гетерозисных гибридов, проявляющих повышенные продуктивные качества по сравнению с родительскими формами /79,80,84/. Так, например, использование гетерозисных гибридов сельскохозяйственных животных и растений обеспечивает повышение продуктивности животноводства на 10-20% и увеличение урожайности сельскохозяйственных культур на 10-30%. Однако несмотря на широкое использование данного явления, гетерозис до сих пор принадлежит к числу биологических проблем, сущность которых до сих пор еще не вполне разгадана.
Существует несколько гипотез, объясняющих природу гетерозиса. Так, гипотеза доминирования объясняет возникновение гетерозиса суммарным действием доминантных генов. Рецессивные гены при переходе в гетерозиготное состояние подавляются доминантными и не угнетают жизнеспособность особей. Таким образом, гетерозис возникает в результате межгенной комплементации. Однако в работах Ли /212/ и Кру /160/ было показано, что жизнеспособность гибридов может быть увеличена за счет доминирования не более чем на 5$. Вместе с тем, экспериментальные работы проведенные на растениях /191/, дрозофиле /151/ позволяют считать гипотезу доминирования приемлемой, особенно в случае скрещивания инбредных линий.
Согласно гипотезе сверхдоминирования гетерозис может возникнуть в случае гетерогенности по одному гену, когда усиление жизнедеятельности гибрида достигается межаллельной комплементацией. В этом случае гетерогенное состояние даже одного гена способствует лучшему протеканию отдельных процессов в организме, чем каждый из аллелей в гомозиготном состоянии. Подтверждением этой гипотезы могут служить работы, показавшие, что у гетерозигот часто присутствуют белки, характерные для каждого из родителей /131/. Например, у гетерозисных гибридов тутового шелкопряда обнаружены оба изофер-мента эстераз и фосфатаз, каждый из которых в отдельности характерен для одного из родителей /160/. По такому же принципу происходит и наследование групп крови человека /163/.
Однако каждая из этих гипотез не охватывает всех возможных сторон возникновения и проявлений гетерозиса. В связи с этим Дуби-нин Н.П. /29/, Турбин Н.В. /123/, Кирпичников B.C. /39/ и другие авторы /141,41,136/ приходят к заключению, что гетерозис возникает при совмещении как межгенной, так и межаллельной комплементации, то есть при гетерозисе явления доминирования и сверхдоминирования дополняют друг друга.
Наряду с двумя основными гипотезами возникновения гетерозиса, существуют и другие взгляды относительно этого явления. Так, например, Струнников В.А.считает одной из возможных причин гетерозиса образование "компенсаторного комплекса генов" /108/, а Шахба-зов В.Г. /134,135/ предполагает возможность биофизических механизмов, обусловливающих изменение заряда ядра и клеток гетерозисных гибридов.
Все существующие гипотезы возникновения гетерозиса базируются на специфических морфологических, физиолого-биохимических и биофизических особенностях этого явления. К морфологическим признакам следует отнести усиленный рост и развитие как отдельных органов и тканей гетерозисных гибридов, так и всего организма в целом. Гете-розисные гибриды уже на стадии эмбриогенеза превосходят родительские формы по интенсивности роста и развития зародыша. Отмечено, что эмбрионы гибридов свиней проходят стадии развития внутренних органов в более короткий срок, чем эмбрионы чистопородных животных /59,30/. Такая же зависимость обнаружена в динамике роста эмбрионов помесных овец /62/. У эмбрионов кур гетерозис проявляется уже в первые часы жизни и выражается в более интенсивном росте и развитии бластодиска, мезодермы и первичной полоски нервной трубки по сравнению с исходными формами /82/.
Усиленный рост соматических и репродуктивных систем гетерозисных гибридов и повышенная их выживаемость сохраняется в постна-тальном периоде, особенно в первые месяцы жизни. Например, гибридные цыплята меньше подвержены заболеваниям и быстрее прибавляют в весе /83,69/, у гетерозисных поросят /20,81/ и ягнат /62/ и гетерозисных гибридов других видов животных /72/ отмечаются ускоренные темпы роста и повышенная жизнеспособность.
Морфологические признаки тесно связаны с генетическими и фи-зиолого-биохимическими особенностями организма. Усиленный рост в первую очередь, обусловлен интенсификацией биосинтеза нуклеиновых кислот и белков. В связи с этим Холден /176/ выдвинул концепцию "биохимического обогащения" при гетерозисе. Эта гипотеза была принята рядом исследователей и получила дальнейшее развитие в работах Турбина Н.В. /123/, Кушнера Х.В. /50/, Кирпичникова B.C. /39,40/. Биохимическое обогащение может проявляться на различных уровнях организации гетерозисного организма: от органов и тканей, до отдельно функционирующих молекул. Так, следует отметить, что в ряде случаев гетерозисные гибриды превосходят родительские формы по скорости синтеза РНК /137,127,13/ и белков /68,19,138/. Рядом авторов, например, отмечено более высокое содержание общего белка в сыворотке крови гетерозисных цыплят /25,63,76/, утят /130/ и помесных телят /72/, в сыворотке крови и тканей свиней /128/ и овец /62/. Гибридные цыплята в отдельные возрастные периоды, превосходят одновозрастных особей родительских пород по количеству белка в печени и грудной мышце на 5-12$ /111,19/. Интенсификация синтетических процессов требует дополнительных затрат энергии или рациональной реализации имеющихся ее запасов. На более совершенное использование энергетических ресурсов тканей может косвенно указывать высокое содержание креатинфосфата, отмеченное у гетерозисных цыплят /70/ и овец /62/, а также ускорение окислительно-восстановительных реакций, проявляющееся в виде усиленного газообмена /21/.
Функциональная изменчивость структуры и свойств альбумина сыворотки крови
Основной физиологической функцией альбумина является транспорт метаболитов, гормонов, ионов металлов, витаминов, лекарственных препаратов /107,226,227,228,178/. Перенос альбумином различных по химической природе веществ возможен благодаря наличию в молекуле белка специфических и неспецифических центров ассоциации. Образование комплекса "белок-вещество" происходит за счет перегруппировки внутримолекулярных связей, что, в свою очередь, приводит к изменению конформации и физико-химических свойств альбумина. Наиболее изученным в этом аспекте можно считать процесс комплексирова-ния альбумина с жирными кислотами.
Транспорт жирных кислот в организме осуществляется преимущественно сывороточным альбумином /173,241,206/. Из общего количества жирных кислот, связываемых альбумином, около 90% приходится на долю жирных кислот с 16 и 18 углеродными атомами /22,246/. Комплексирование альбумина с жирными кислотами происходит по типу гидрофобного взаимодействия /241/.
Центры ассоциации альбумина с жирными кислотами представляют собой погруженные внутрь глобулы участки полипептидной цепи, состоящие из остатков неполярных аминокислот и ограниченные двумя положительно заряженными остатками аргинина и лизина, свободные NH2-группы которых находятся на поверхности молекулы.
Клотц /259/ установил структуру одного из таких центров для сывороточного альбумина человека, представляющего собой участок полипептидной цепи, состоящий из -Lys-Aiarp-Aia-Val-Aia-Arg-. Аналогичные участки были установлены и для альбумина быка /175, 193/. Существует мнение, что процесс ассоциации альбумина с жирными кислотами проходит ступенчато. Вначале осуществляется взаимодействие карбоксильной группы жирной кислоты со свободной аминогруппой аргинина или лизина, расположенной на границе гидрофобного центра /213,236/. Затем происходит внедрение углеводородного радикала жирной кислоты в гидрофобную полось белка и освобождение карбоксильной группы /236,220/.
В условиях организма молекула альбумина переносит одну-две молекулы жирных кислот /227/, однако в некоторых случаях это количество увеличивается /273,228,206/. Таким образом, в молекуле альбумина существует несколько центров ассоциации с жирными кислотами, которые локализуются на границе 2 и 3 доменов, а также находятся в области 2с, За и Зв субдоменов /224,178,206/. Заполнение центров жирными кислотами приводит к существенному изменению свойств белка /196,240,237/. Молекула альбумина, соединяясь с жирной кислотой, увеличивается в объеме при уменьшении соотношения осей симметрии белковой глобулы /168,253/. Поверхностное расположение карбоксильных групп жирных кислот связанных с альбумином увеличивает суммарный отрицательный заряд молекулы в целом /226/, вследствие чего происходит смещение изоэлектрической точки белка на 0,6-0,7 единиц рН в сторону кислых значений, по сравнению с обезжиренным альбумином.
Известно, что жирные кислоты, помимо указанного влияния на структуру альбумина, повышают устойчивость белка к действию денатурирующих факторов. Так, в частности, денатурация альбумина в присутствии жирных кислот и их солей происходит при более высокой температуре /201,214,144/. Существенным моментом в стабилизации белковой молекулы является длина углеводородного радикала жирной кислоты. Было отмечено, что увеличение углеводородного радикала связываемой альбумином жирной кислоты приводит к повышению температуры и времени денатурации /214/. Измерения удельного вращения и вращательной дисперсии показали, что нагревание сывороточного альбумина человека до 50-60С в присутствии каприлата или капрата натрия не приводят к денатурации белка, а в присутствии детергентов денатурация происходит только при 80С /31/.
Защитный эффект жирных кислот, их солей и детергентов, то есть веществ с относительно большой длиной углеводородного радикала, может быть связан со стабилизацией гидрофобных взаимодействий и взаимодействий типа Ван-дер-Ваальсовых сил внутри белковой молекулы /23,241/, что предотвращает нарушение конформации молекулы альбумина в целом /9,206/. Подтверждением этого предположения может служить повышенная устойчивость альбумина ассоциированного с жирными кислотами к действию протеаз /227,178/.
Транспорт жирных кислот осуществляется альбумином всех позвоночных животных, но механизму этого процесса свойственны видовые особенности. Так, по активности ассоциации пальмитиновой кислоты альбумин быка превосходит альбумин кролика и человека, а альбумин кролика связывает пальмитат активнее, чем альбумин человека /255/ При комплексировании с пятью молекулами жирных кислот диэлектрический инкремент альбумина человека в три раза превышает эту величину в бычьем альбумине /251/.
Таким образом, изменения свойств сывороточного альбумина, обусловленные его ассоциацией с жирными кислотами, зависят не только от природы этих метаболитов, но и от видовых особенностей структуры самой белковой молекулы.
Для большинства метаболитов установлены видовые особенности образования комплексов с альбумином. Так было отмечено, что в некоторых случаях происходит переход гема с гемоглобина на сывороточный альбумин. Однако у млекопитающих такой переход возможен только для альбумина человека и обезьяны /156/. В то же время, у лягушек наблюдается интенсивное комплексирование альбумина с ге-мином /267/.
Определение молекулярной массы фильтрацией в тонком слое сефадекса
Изучение биохимических особенностей гетерозисних особей проводится в настоящее время на примере разнообразных селькохозяйст-венных объектов, имеющих практическую значимость.
Материалом наших исследований служила кровь кур, селекциниру-емых в направлении выведения мясного гибрида, проявляющего гетерозис по живой массе, Крымским филиалом Украинского научно-исследовательского института птицеводства на базе опытного хозяйства совхоза им. Дзержинского Симферопольского района Крымской области. С этой целью хозяйством в качестве отцовской формы использованы петухи породы белый корниш различных линий. В качестве материнской - куры пород родайланд, нью-гемпшир, белый плимутрок /124,77/. В результате проведенной работы было найдено сочетание родительских линий чистопородных кур, дающих интенсивно растущее гибридное потомство. Такой родительской парой оказались петухи породы белый корниш линии К-2 и куры породы белый плимутрок линии П-6 /124,77,78/.
Белый корниш - это мясная порода кур, которая повсеместно используется в качестве отцовской формы при получении гибридных цыплят - бройлеров, обладающих интенсивным ростом в первые месяцы жизни /71/. Живая масса цыплят белого корниша в 56-дневном возрасте достигает 1102,5 г. Масса взрослых особей в среднем равна 4,8 кг для петухов и 3,6 кг для кур /71,79/.
Белый плимутрок является породой кур мясо-яичного типа, получившей широкое распространение в качестве материнской формы при выращивании бройлеров. Средняя живая масса 56-дневных цыплят белого плимутрока равна 1032,5 г, а"у взрослой птицы она составляет около 3,8 кг для петухов и 2,9 кг для кур /71,79/.
Гибридные цыплята, полученные в результате скрещивания К-26 х П-6о_, отличаются более интенсивным ростом по сравнению с цыплятами исходных родительских пород. Так в возрасте 56 дней живая масса гибридов достигает I33I-I460 г, причем расход кормов на I кг привеса равен 2,4 кг, что составляет 89, по отношению к соответствующим затратам кормов, расходуемых при выращивании чистопородных цыплят исходных родительских линий /78,79,80/. Эти показатели, наряду с высокими вкусовыми качествами мяса гибридных цыплят, являются предпосылкой к их выращиванию в промышленном масштабе. Так, совхозом им. Дзержинского ежегодно выращивается и сдается государству более 3 млн. голов таких гибридов. В 1971 г. крое K-2cf х П-б был признан чемпионом ВДНХ.
Таким образом, гибриды, получаемые при скрещивании кур пород белый корниш линии К-2 (петухи) и белый плимутрок линии П-б (куры) обладает явными признаками гетерозиса по интенсивности роста, живой массе и использованию питательных веществ. В связи с этим, они могут служить объектом, при выяснении биохимических особенностей гетерозисных организмов.
В настоящей работе в качестве объекта исследований были выбраны гибридные и чистопородные цыплята родительских форм белый корниш линии К-2 и белый плимутрок линии П-6 в 60-дневном возрасте, а также племенная птица этих же линий, в возрасте 16 месяцев. Чистопородные особи и гибриды были любезно предоставлены опытным хозяйством УкрНИИП совхоза им. Дзержинского. Материалом исследований служил альбумин сыворотки крови. Для получения белка кровь брали у практически здоровых цыплят и племенной птицы одноразово путем вскрытия подъязычной вены. Сыворотку собирали над сгустком через 6-12 часов после взятия крови. Альбумин из сыворотки крови получали препаративным электрофорезом в агаровом и полиакриламидном гелях. Препаративный электрофорез в геле агара проводили в веронало-вом буфере рН 8,6, используя прибор с водяным охлаждением, изготовленный в лаборатории из плексигласа согласно рекомендаций Ю.Н.Гордеева /24/ и Д.А.Соркиной /90/. Продолжительность опыта составляла 4-5 часов при напряжении 10 в/см. Зону геля, соответствующую альбуминовой фракции, которую обнаруживали при погружении узкой боковой контрольной полоски геля в 20%-ный раствор трихлор-уксусной кислоты, вырезали и белок из геля выделяли последовательным его замораживанием и оттаиванием /90/. Полученный раствор альбумина диализировали против дистиллированной воды в течение 48 ч при 4С. Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле проводили согласно модификации предложенной Г.Ю.Ажицким и С.Н.Багдасарьян /З/ в блоках 7%-ного геля в плексигласовом приборе, изготовленном в лаборатории. Использовали трис-глициновый буфер рН 8,3, напряжение 7 в/см в течение б ч. Для приготовления полиакриламидного геля использовали реактивы фирмы " Reanal " (Венгрия). По окончании электрофореза вырезали узкую контрольную полоску с боковой части геля и по ней устанавливали положение альбуминовой фракции после погружения в 20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. Соответствующий альбумину участок вырезали из блока полиакриламидного геля, суспензировали с 10 мл дистиллированной воды и оставляли на 24 ч при 4С. Раствор белка отделяли от измельченного геля фильтрованием. Полученный раствор альбумина диализировали против дистиллированной воды в течение 48 ч при 4С.
Исследование пептидного состава триптических гидролизатов (метод пептидных карт)
При изучении первичной структуры белков, особенно в сравнительных исследованиях гомологичных белков с неустановленной аминокислотной последовательностью, часто применяется метод "пептидных карт". Принцип этого метода состоит в сочетании высоковольтного электрофореза с распределительной хроматографией на бумаге или других поддерживающих средах. Электрофорез и хроматография, проводимые во взаимно перпендикулярных направлениях, позволяют получать строго индивидуальную картину распределения пептидных фрагментов ферментативных гидролизатов белков, что может служить признаком общности их структуры или указывать на существующие различия. Топография пептидов на карте является уникальной для данного белка и любые изменения в первичной структуре могут быть обнаружены указанным методом, который получил название "отпечатков пальцев" или пептидных карт /185/.
Пептидные карты сывороточного альбумина получали двумя способами: на бумаге и в тонком слое целлюлозы. В обоих случаях гидролиз белка осуществляли трипсином фирмы "Спофа" (ЧССР), при фермент-субстратном отношении 1:50. Коммерческий препарат трипсина обрабатывали 0,06 н раствором соляной кислоты для удаления возможных примесей химотрипсина /36/. Перед гидролизом альбумин денатурировали теплом в течение 40 мин на кипящей водяной бане. Гидролиз проводили в аммиачно-карбонатном буфере рН 8,4 в течение 24 ч при 40С. Полученный гидролизат высушивали в водяных парах при Ю0С и растворяли в буфере, используемом для электрофореза. Нерастворившийся осадок ("коровые пептиды") удаляли центрифугированием.
Для получения пептидных карт использовали хроматографическую бумагу "F № 4" фирмы " Fiitrac " (ГДР). Раствор пептидов в количестве 30-40 мкл наносили в виде узкой полоски длиной I см на лист хроматографической бумаги размером 50 х 36 см на расстоянии 29 см от края листа, обращенного к катоду. Высоковольтный электрофорез проводили в пиридин-ацетатном буфере рН 5,2 в специализированной камере прибора для высоковольтного горизонтального электрофореза типа "ОЕ-402" (Венгрия). Продолжительность электрофореза составляла 105 мин при напряжении 30 в/см. После окончания электрофореза карту высушивали на воздухе, затем проводили двухразовую восходящую хроматографию в системе пиридин - н-бутанол -уксусная кислота - вода в соотношении 10:15:3:12. По окончании хроматографии карты высушивали в токе воздуха и проявляли нингид-риновым реактивом /10/, помещали в термостат при 60С и после полного проявления всех пептидных фрагментов их окраску закрепляли 0,2$-ным раствором азотнокислой меди в ацетоне. Сравнение полученных пептидных карт и расчет пептидных фрагментов проводили по зонам электрофоретической подвижности - анодной, катодной и нейтральной и согласно коэффициентов хроматографического распределения ( Rf).
Пептидные карты в тонком слое целлюлозы осуществляли на целлюлозном порошке, который готовили из хроматографической бумаги «F № II" (ГДР) согласно рекомендациям Катрухи Г.С. /38/. Суспензию целлюлозы в воде, приготовленную из расчета 3 г порошка на 10 мл воды, наносили на обезжиренную стеклянную пластину размером 20 х 20 см. Равномерной толщины слоя добивались путем распределения суспензии покачиванием пластины с последующим высушиванием на строго горизонтальной поверхности при комнатной температуре.
После высыхания целлюлозы пластину пропитывали, по типу восходящей хроматографии, электродным буфером рН 4,7, состоящим из пиридина - н-бутанола - уксусной кислоты - воды в соотношении 1:2:1:36. Затем пластину помещали в аппарат для высоковольтного электрофореза, который был изготовлен в лаборатории из органического стекла с применением оригинальной системы охлаждения (рис.6) /91,93/. Охлаждающим блоком в приборе служила камера, на металлическую пластину которой помещали стеклянную пластину. Поверхность металлической пластины для предотвращения коррозии и с целью изоляции покрывали аэрозолью нитроэмали. Контакт слоя целлюлозы с буфером в электродных камерах аппарата осуществляли при помощи двухслойных фитилей из хроматографической бумаги, обернутой для предотвращения подсыхания целлофаном.
Раствор гидролизата в количестве 3 мкл наносили в виде по лоски в I см на расстоянии 8 см от анодного конца и 4 см от края пластины. Электрофорез проводили в течение 65 мин при следующих режимах: первые 15 мин градиент напряжения составлял 50 в/см, следующие 50 мин - 30 ЭЙсм. По окончании электрофореза пластины высушивали на воздухе и проводили в перпендикулярном электрофорезу направлении двухкратную хроматографию в системе пиридин - н-бутанол - уксусная кислота - вода (10:15:3:12). Хроматографию проводили в строго горизонтальном положении пластины: контакт целлюлозного порошка с растворителем осуществляли посредством бумажного фитиля соответствующего ширине пластины. После хроматографии пластину высушивали в термостате при 90С в течение 15 мин и окрашивали нингидриновым реактивом /10/. Для проявления пятен и развития окраски пластины помещали на 5 мин в термостат при 60С, затем переносили в специальную темную камеру. Сравнение пептидных наборов проводили, как и в случае пептидных карт на бумаге, по зонам электрофоретической подвижности.
