Введение к работе
Глуташнсинтетаэа (ГС; Н.Ф. 6.S.1.2), каталЕЗпруадая реакцию синтеза глутамина, является одним из важнейдах фер:кентов азотного обмена (Кретович, 1972). Центральное положение, которое занимает гдуташн в азотном обмене растений, определяется на только тем, что он является первичным продуктом ассимиляции аммиака, но такга тем» что реакция его синтеза является "пусковой" реакцией нескольких разветвленных метаболических путей, приводящих к синтезу пуринових, шриійздиновнх соединений, гл»-козагдш-6-фосфата, карбамоил-фосфата и др. ( Stac&nan, 1973; Нв&еь, 1973).
Актуальность теми. Структура регуляторного (аллостерцче-ского) фермента ГС, обладавшего как и всякий регуляторний фермент не только каталитической функцией, но к функцией регуляции целых метаболических цепей, представляет несомненный интерес.
В настоящее время имеются данные о структуре ГС бактерий и животных, к отсутствуют дапние о структуре и физико-химических свойствах ГС автотрофних организмов *- в том числе хлореллы.
Изучение структуры и физико-химических свойств ГС как ключевого, регуляторного фермента хлореллы представляет интерес в связи с вопросами направленности азотного метаболизма этой водоросли, используемой как источник кормового белка, витаминов и биологических стимуляторов (Иузафаров и соавт., 1974). Иммо- . билизованная ГС мохет быть использована в медицине как фермент, устранящяй из тока крови токсичный для организма аммиак, переводя его в глутаман, л в производстве для синтеза L -глутамина.
Цель и задач:і исследования. Целью данной работы явилось исследование четвертичной структуры и некоторых физико-хишческих свойств ГС СА&м&а. /уїелоікоїо. . Исходя из цели работы,были поставлены следувдие задачи:
-
Получить гомогенный препарат ГС из клеток хлореллы, выращенной автотрофно.
-
Изучить условия диссоциации молекул ГС с целью получения дополнительной информация о четвертичной структуре фермента, молекулярном весе фермента и его мономеров, а также характере связей, участвушях и пим«У^ьшг"алйго,мерноЙ струк-
Т і^її;?. сучмЛ'-1^.-. >
Т і;і:,;, кучм* а»-*-*,.. j
' Itl-e;//"
туры фермента.
-
Установить аминокислотный состав, изоэлектрическую точку и выяснить значение двухвалентных катионов для стабилизации структуры фермента и проявленая его активности.
-
Исследовать четвертичную структуру ГС с по^ющью метода электронной микроскопии.
-
Получать иммобилизованную форму ГС хлореллы.
-
В связи с вопросом о налички в клетках хлореллы механизма регуляции ГС путем диссоциации - ассоциации фермента исследовать диссоциацию ГС хлореллы под действием мочевины различной концентрации и влияние на этот процесс субстратов.
7. Выяснить наличие и роль SH-групл цистеина и имидазольной
:грушш гистадпна в активном центре ГС хлореллы.
8> Разработать методику определения активности ГС потевцяомет-рлческим методом.
Научная новизна работы. В результате проведенных исследований, впервые из клеток хлореллы выделен гомогенный препарат ГС, охарактеризованный методами диск-электрофореза и аналитического ультрацентрифугировакия. Установлен молекулярный вес фермента и его мономеров, определен аминокислотный состав и изоэлектрическая точка. Исследовано пространственное располо-Еензе мономеров ГС и показано, что молекула фермента состоит из шести мономеров, располоаеняых с точечной группоа симметрии 32. Такой тип структуры из всех исследованных ГС показан только для ГС хлореллы.
Установлено, что ГС хлореллы отличается высокой стабильностью. При выделении и хранении для ГС хлореллы, в отличие от ГС других организмов, не требуется присутствие двухвалентных катионов, цистеила, ЭДШ и др.
Впервые осуществлена иммобилизация ГС на йь^-активирован-
ной сефарозе. '
Разработана новая методика определения активности ГС.
Показано, что при диссоциации ГС хлореллы распадается ка неактивные мономеры без образования промежуточных молекулярных форм.
Практическая ценность работы. Полученные в работе данные углубляют нахи знания о структуре, свойствах, механизме действия и регуляции активности ГС и некоторых общих особенностях механизма действия этого фермента,'внося определенный вклад в
развитие фундаментальных исследований в области энэимологии.
В иммобилизованном состоянии ГС хлореллы может быть использована для синтеза і -гдутамина, а также в медицине.
Ащюбацая работы. Основные пологения диссертации доложены
и обсуздены на: і
советско-американском слдаоэиуме по химии белка, Рига, 1976;
всесоюзной конференции по электронной микроскопии, Ташкент, 1976;
конференции молодых ученых Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР,-1976;
материалы диссертационной работы отмечены премией на конкурсе научно-технического творчества молодежи Института биохимии им. А.Н.Баха, посвященной 60-летию Великой Октябрьской революции, 1977;
работа отмечена П-й премией на конкурсе за лучшую научную работу Института биохимии им. А.Н.БахаМН СССР, посвященном 60-летяю Великой Октябрьской революции, 1977.
Публикации. Ло теме диссертации опубликовано 8 работ.
Объем работы. Диссертация изложена на f^a страницах текста и содерїят таблиц 7 и ^рисунков. Список литературы включает отечественных 4f и /SS иностранных публикаций.
