Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков 12
1.2. Суперсемейство цитохромов Р450 13
1.2.1. Подсемейство CYP1А 16
1.2.2. Подсемейство СYP2B 21
1.2.3. Подсемейство CYP2C 22
1.3. НАДФН-цитохром Р450 редуктаза 22
1.4. Глутатион-Б-трансферазы 24
1.5. Механизмы регуляции экспрессии генов цитохромов Р450 27
1.5.1. Регуляция экспрессии генов CYP1A 29
1.5.2. Регуляция экспрессии генов CYP2B 42
1.5.3. Регуляция экспрессии генов CYP2C 46
1.6. Витамин Е ( а-токоферол) 47
1.6.1. Метаболизм витамина Е 49
1.6.2. Функции витамина Е 51
1.6.3. а-токоферол и цитохромы Р450 53
1.7. Витамин К (менадион) 55
1.7.1. Метаболизм витамина К 57
1.7.2. Функции витамина К 58
1.7.3. Витамины К и цитохромы Р450 60
ГЛАВА 2. Материал и методы 62
2.1. Материалы 62
2.2. Животные 62
2.3. Методы исследования. 63
2.3.1. Выделение микросом и цитозолей печени крыс 63
2.3.2. Определение количества белка в микросомах и цитозолях 64
2.3.3. Определение количества цитохромов Ь5 и Р450 в микросомах печени крыс 64
2.3.4. Определение активности НАДФН-цитохром Р450редуктазы 64
2.3.5. Определение активности глутатион-Б-трансферазы в цитозоле печени крыс 64
2.3.6. Определение активностей CYP1A1, CYP1A2, CYP2B и CYP2C в микросомах печени крыс 65
2.3.7. Количественное определение малонового диалъдегида 65
2.3.8. Определение токоферолов в микросомах печени крыс 66
2.3.9. Диск -электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле 66
2.3.10. Полусухой электроперенос беков на нитроцеллюлозную мембрану 66
2.3.11. Иммунохимический анализ белков микросом 67
2.3.12. Выделение суммарной РНК из клеток печени крыс 68
2.3.13. Электрофорез РНК в частично денатурирующих условиях 69
2.3.14. Определение концентрации РНК 70
2.3.15. Определение уровня мРНК CYP1A1, CYP1A2, AhRuArnt 70
2.3.16. Выделение экстракта ядер клеток печени 73
2.3.17. Определение белка в экстрактах ядер 74
2.3.18. Приготовление зонда для ДНК/белкового связывания 74
2.3.19. Анализ ДНК/белковых комплексов 75
2.3.20. Исследование действия неферментного перекисного окисления липидов на активность CYP1A1 75
2.3.21. Исследование действия а-токоферола и менадиона на активность CYP1A1 in vitro 76
2.4. Статистическая обработка 76
ГЛАВА 3. Результаты 77
3.1. Исследование активностей ферментов биотрансформации ксенобиотиков печени крыс и характеристик перекисного окисления липидов in vivo 77
3.1.1. Влияние а-токоферола на ферменты биотрансформации ксенобиотиков и процессы перекисного окисления липидов 77
3.1.2. Влияние менадиона на ферменты биотрансформации ксенобиотиков и процессы перекисного окисления липидов 82
3.2. Исследование механизмов, лежащих в основе индукции активности CYP1A под действием менадиона и а-токоферола 87
3.3. Исследование способности а-токоферола и менадиона активировать AhR 91
3.4. Влияние а-токоферола и менадиона при совместном введении с бензо(а)пиреном in vivo на экспрессию генов CYP1A и процессы перекисного окисления липидов в печени крыс 94
3.5. Влияние менадиона и а-токоферола на активность CYP1A1 микросом печени крыс, индуцированных бензо(а)пиреном in vitro 99
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 103
4.1. Индуцирующий эффект а-токоферола на активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков печени интактных крыс и механизмы, лежащие в основе индукции CYP1A 103
4.2. Индуцирующий эффект менадиона на активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков печени интактных крыс и механизмы, , лежащие в основе индукции CYP1A
4.3. Индуцибельность CYP1А 107
4.4. Возможные механизмы индукции СYP2B1, CYP2C, НАДФН-цитохром Р450 редуктазы и глутатион-Б-трансферазы 109
4.5. Ингибирующие эффекты а-токоферола и менадиона на индуцируемые бензо(а)пиреном активности CYP1A и механизмы, лежащие в их основе... 110
Выводы 115
Список литературы 116
- Суперсемейство цитохромов Р450
- Метаболизм витамина К
- Исследование механизмов, лежащих в основе индукции активности CYP1A под действием менадиона и а-токоферола
- Индуцирующий эффект а-токоферола на активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков печени интактных крыс и механизмы, лежащие в основе индукции CYP1A
Введение к работе
Ферменты биотрансформации ксенобиотиков защищают организм от воздействия чужеродных химических соединений, которые не встраиваются в нормальную цепь биохимических превращений в организме, осуществляя детоксикацию и выведение из организма самых разнообразных по своей химической структуре и биологической активности веществ как экзогенного, так и эндогенного происхождения - лекарств, промышленных химикатов, химических факторов загрязнения окружающей среды, пестицидов, продуктов пиролиза пищевых продуктов, алкалоидов, вторичных метаболитов растений, токсинов плесеней, растений и животных, стероидов, гормонов, жирных кислот (Ляхович В.В., Цырлов И.Б.,1978).
Процесс биотрансформации протекает в две фазы. Ключевым ферментом первой фазы является цитохром Р450, основной реакцией которого является монооксигеназная, при этом один атом кислорода взаимодействует с субстратом, а другой восстанавливается до воды. Широкая субстратная специфичность данного фермента обусловливается его существованием в виде множественных форм. В ходе реакции, катализируемой цитохромом Р450, используются два электрона, первый из которых поставляется НАДФН-цитохром Р450 редуктазой, а второй -предположительно, цитохромом Ь5. Ферменты второй фазы осуществляют реакции глюкуронидации, сульфатирования, метилирования и гидроксилирования, эти реакции приводят к значительному увеличению гидрофильности ксенобиотиков, что способствует их выведению из организма (Grant D.M., 1991, Parkinson А., 1996).
Одними из представителей суперсемейства цитохромов Р450 (CYP) являются цитохромы Р450 подсемейства 1 А, состоящего из двух членов - цитохрома Р4501А1 (CYP1A1) и цитохрома Р4501А2 (CYP1A2). CYP1A метаболизируют два наиболее распространенных класса загрязнителей окружающей среды - полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) и ароматические амины, катализируя как реакции детоксикации, так и реакции токсикации этих соединений. Продукты, образованные в ходе окислительного метаболизма ПАУ CYP1A, являются субстратами ферментов второй фазы метаболизма ксенобиотиков, в частности, глутатион-8-трансферазы (ГСТ).
CYP1A1 и CYP1A2 являются индуцибельными ферментами, их количество в нормальных тканях возрастает при воздействии специфических веществ -индукторов. К настоящему времени накоплены обширные сведения об индукции цитохромов этого подсемейства экзогенными липофильными веществами, такими как ПАУ, которые активируют транскрипцию генов CYPIA через путь сигнальной трансдукции, зависимый от рецептора ароматических углеводородов (AhR). AhR является цитозольным белком, который после связывания с лигандом переносится в ядро, где взаимодействует с белком Arnt. Гетеродимер Ahr/Arnt приобретает способность взаимодействовать с энхансерной последовательностью XRE3, после чего происходит изменение нуклеосомной укладки промотора и начинается транскрипция AhR-зависимых генов (Ma Q., 2001). Для CYP1A1 это единственный показанный на сегодняшний день механизм индукции (Whitlock J.P., 1999; Ma Q., 2001). Механизмы индукции CYP1A2 менее изучены, и имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что активация этого цитохрома может осуществляться как на транскрипционном (через AhR-зависимый или независимый путь сигнальной трансдукции), так и на посттранскрипционном уровнях (Sogawa К. et al., 2004, Quattrochi et al., 1994; Ryu D.Y. et al., 1997; Adams N.H., 1993; Xu L.C., Bresnick E., 1990).
Исследования последних десятилетий показывают, что спектр индукторов CYP1A гораздо шире, чем предполагалось: среди них есть и природные вещества, например, компоненты пищи, такие как флавоноиды, индолы, каротиноиды (Ioannides С, 1999; Denison M.S., Nagy S.R., 2003). Более того, способность CYP1A к индукции под действием некоторых физических факторов: ультрафиолетового и ультразвукового облучений, холодового воздействия и гипероксии, а также в некоторые периоды эмбрионального развития, предполагает существование эндогенного индуктора (Гришанова А.Ю., Зуева Т.В., 2000, Громова О.А и др., 2004). Показано, что некоторые вещества, образующиеся в ходе метаболизма, такие как билирубин, производные триптофана, активные формы кислорода, способны повышать активность CYPIA (Heath-Pagliuso S. et al., 1998; Wei Y.D. et al., 1999; Гришанова А.Ю., Зуева T.B., 2000).
Большинство известных индукторов активностей CYP1A имеют схожие черты химической структуры - это липофильные вещества, которые содержат ароматические кольца. К жирорастворимым соединениям, имеющим в своем составе ароматические компоненты, относятся а-токоферол (витамин Е) и менадион (витамин К). Оба вещества широко используются в практической медицине. Витамин Е применяется как антиоксидант в лечении патологических состояний, связанных с активацией процессов перекисного окисления липидов в организме. Витамин К, синтетическим аналогом которого является менадион, обладает антигеморрагическим действием.
В литературе имеются немногочисленные сведения об участии витаминов Е и К, как регуляторных молекул в клеточных процессах, не связанных с антирадикальной и кровосвертывающей способностью (Birgelius-Flohe R., Traber M.G., 1999; Azzi А., Stocker А., 2000; Saxena S.P. et al., 2001). Влияние а-токоферола и менадиона на ферменты биотрансформации ксенобиотиков изучено недостаточно.
Существующие на сегодняшний день результаты исследований, посвященных данной проблеме, противоречивы и получены в основном либо на культурах клеток, либо с использованием генно-инженерных конструкций (Chen Y.T., Ding J.H., 1987; Inouye K.et al., 1999). Так, в культуре клеток HepG2 а-токоферол повышал БП-гидроксилазную активность, частично опосредованную CYP1A1 (Chen Y.T., Ding J.H., 1987). С другой стороны, введение витамина Е крысам снижало БП-гидроксилазную активность в печени и повышало в других тканях (Gairola С, Chen L.H., 1982). Менадион в культурах клеток вызывал увеличение БП-гидроксилазной активности и содержания специфической мРНК генов CYP1A (Chen H.W., Ding J.H., 1987), но у Salmonella менадион ингибировал специфические для CYP1A1 и CYP1A2 7-этокси- и 7-метоксирезоруфин-О-деалкилазные активности (Edenharder R. et al, 1999). У мышей менадион снижал скорость метаболизма бензо(а)пирена (Israels LG, et al, 1983). Механизмы, лежащие в основе этих эффектов, неизвестны.
Изложенное выше определило цель настоящей работы: изучить влияние а-токоферола и менадиона на активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков печени интактных и бензо(а)пирен-индуцированных крыс Вистар и исследовать механизм, лежащий в основе предполагаемого модулирующего действия данных соединений на CYP1A.
Это предполагало решение следующих задач:
1. Определить активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков (CYPIA, CYP2, НАДФН-цитохром Р450 редуктазы и глутатион-8-трансферазы) в печени крыс в зависимости от дозы и длительности введения а-токоферола или менадиона.
2. Оценить способность менадиона и а-токоферола вызывать изменение количества белка и мРНК CYP1A, мРНК AhR и Arnt.
Оценить влияние менадиона и а-токоферола на ДНК-связывающую активность комплекса AhR/Arnt.
Определить активности CYP1A и относительное содержание мРНК CYP1A1 и CYP1A2 при совместном введении а-токоферола или менадиона с бензо(а)пиреном in vivo.
Исследовать влияние а-токоферола и менадиона на активность CYP1A1 in vitro.
Научная новизна
Впервые показана способность а-токоферола и менадиона индуцировать ферменты биотрансформации ксенобиотиков (CYPIA, CYP2, НАДФН-цитохром Р450 редуктазы и ГСТ) в печени интактных крыс.
Впервые установлены механизмы индукции CYP1A под действием менадиона и а-токоферола. Индуцирующее влияние менадиона реализуется на транскрипционном уровне через AhR-зависимый путь сигнальной транедукции. Индукция а-токоферолом осуществляется как на транскрипционном уровне через AhR зависимый путь сигнальной транедукции, так и на посттранскрипционном уровне.
Выявлено, что а-токоферол и менадион способны ингибировать активность CYP1A1 in vitro в БП-индуцированных микросомах.
Показана способность а-токоферола и менадиона ингибировать индуцируемые бензо(а)пиреном активности CYPIA in vivo.
Впервые установлен механизм, лежащий в основе ингибирующего эффекта менадиона на бензо(а)пирен-опосредованную индукцию CYP1A, который реализуется на транскрипционном уровне.
Научно-практическая значимость.
По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование влияния а-токоферола и менадиона на ферменты биотрансформации ксенобиотиков и молекулярных механизмов индукции CYP1A в печени крыс под действием этих веществ. Полученные результаты имеют значение для понимания механизмов активации экспрессии генов CYP1A.
Практическое значение работы состоит в том, что получены результаты, показывающие неизвестные ранее последствия применения используемых в клинической практике веществ а-токоферола и менадиона - активацию экспрессии генов CYPIA, имеющих отношение к метаболизму проканцерогенов.
Основные положения, выносимые на защиту.
а-Токоферол и менадион в опытах in vivo индуцируют CYPIA, CYP2, НАДФН-цитохром Р450 редуктазу и глутатион-Б-трансферазу в печени крыс.
CYP1A1 и GYP1A2 под действием менадиона индуцируются на транскрипционном уровне с вовлечением сигнального пути Ah-рецептора.
Индукция CYP1A1 под действием а-токоферола реализуется как на транскрипционном уровне, с вовлечением AhR-зависимого пути сигнальной трансдукции, так и на посттранскрипционном, а индукция CYP1A2 - на посттранскрипционном.
а-Токоферол и менадион при введении крысам in vivo ингибируют индуцированные бензо(а)пиреном активности СYP1А в печени.
Менадион ингибирует индуцирующее действие бензо(а)пирена на активности CYP1A1 и CYP1A2 in vivo в печени крыс. Ингибирование активности СYP1A1 происходит вследствие снижения уровня мРНК.
а-Токоферол и менадион ингибируют активность CYP1A1 in vitro в бснзо(а)пирен-индуцированных микросомах.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на международной конференции "Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека" Смоленск, Россия, 2001; на III Съезде Биохимического общества России, Санкт-Петербург, Россия, 2002; на конференции "Биология - наука XXI века" Пущино, Россия, 2003; на международном симпозиуме "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека" Феодосия (Крым), Украина, 2003; на VIII Дальневосточной школе-конференции "Актуальные проблемы химии и биологии, Владивосток, Россия, 2004"; на 9 зимней школе CIMO "Bioinformatics: from molecular mechanisms to functional systems" Хельсинки, Финляндия, 2005.
Автор выражает глубокую благодарность директору НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, академику РАМН, доктору биологических наук, Ляховнчу Вячеславу Валентиновичу и заведующей лабораторией биохимии чужеродных соединений, кандидату биологических наук, Грншановой Алевтине Юрьевне, за руководство работой на всех ее этапах.
Суперсемейство цитохромов Р450
Все цитохромы Р450 относятся к гем-содержащим белкам. Свое название эти ферменты получили за необычное для цитохромов b-типа свойство проявлять максимум поглощения света при длине волны 450 нм в восстановленном состоянии в комплексе с СО (Мишин В.М., Ляхович В.В.,1985). Причиной наличия такого максимума поглощения является существование тиолатной связи между гемовой и белковой частями молекулы. Разрушение этой связи приводит к образованию каталитически неактивной формы с максимумом поглощения при длине волны 420 нм (Parkinson А., 1996).
Основная реакция, катализируемая цитохромами Р450 - монооксигенирование, в ходе которого в молекулу субстрата встраивается один атом кислорода. Полный цикл, приводящий к появлению продукта реакции, отражен на рисунке (рис. 1). Сначала цитохром Р450 в окисленном состоянии взаимодействует с субстратом. На следующем этапе происходит восстановление цитохрома, связавшего субстрат, первым электроном, подаваемым NADPH-цитохром Р450 редуктазой. Затем к восстановленному комплексу присоединяется кислород и происходит восстановление вторым электроном, донором которого, возможно, является цитохром Ь5. Далее следует внутримолекулярное превращение, сопровождающиеся отщеплением продукта реакции, который становится более полярным соединением, чем субстрат (Мишин В.М., Ляхович В.В., 1985).
Предполагают, что в процессе эволюции цитохром Р450 появился с целью конверсии инертных углеводородов окружающей среды до продуктов, используемых с энергетической или пластической целью, или для удаления токсичных гидроперекисей у примитивных организмов, использующих кислород в клеточном дыхании (Гуляева Л.Ф. и др., 1994). Считается, что все ныне существующие гены цитохромов Р450 произошли от единого предшественника, возникшего более 2-х биллионов лет назад путем дивергентной эволюции (Nebert D.W., Gonzales F.J., 1987). Причина увеличения числа цитохромов в последние несколько сотен миллионов лет неясна. Возможно, это связано с выходом водных позвоночных на сушу и последующим изменением характера питания с включением в рацион продуктов, содержащих растительные токсины (Nebert D.W., Gonzalez F.J., 1987; Gonzalez F.J., 1987).
Самые ранние доказательства множественности форм цитохромов Р450 были обнаружены при наблюдении явления сдвига пика поглощения в СО-связанном состоянии (с 450 до 448) цитохромов печени крыс на фоне введения 3-метилхолантрена (3-МХ) (Parkinson А., 1996), а также при обнаружении факта избирательного увеличения монооксигеназных активностей в ответ на введение различных ксенобиотиков. Впоследствие различные формы цитохрома Р450 были выделены из микросом печени контрольных и экспериментальных животных в чистом виде (Astrom A., DePerre, 1986).
По существующим на сегодняшний день оценкам, в клетках любого вида млекопитающих существует 50-60 различных изоформ цитохрома Р450 (McKinnon R.A., 2000; Hedlund Е. et al., 2001). Гены цитохромов Р450 существуют у всех ныне живущих организмов, включая прокариотические. Суперсемейство цитохромов Р450 подразделяется на семейства, подсемейства и индивидуальные формы на основе сходства аминокислотных последовательностей. Белки, имеющие не менее 40% гомологии по аминокислотной последовательности, относят к одному семейству; при наличии более 55% гомологии - к одному подсемейству. Согласно современной номенклатуре, названия индивидуальных цитохромов Р450 состоят из коренного символа CYP (Сур для мышей) - от английского "cytochrome Р450", арабской цифры, обозначающей семейство, латинской буквы, указывающей подсемейство и номера индивидуальной формы. Для обозначения генов рекомендуется итализированная аббревиатура (например, CYP1A1), а для обозначения белков - неитализированная (CYP1A1). У млекопитающих насчитывается, по меньшей мере, 17 различных семейств генов цитохромов Р450, 4 из которых (CYP1-4) кодируют ферменты, метаболизирующие ксенобиотики. Ферменты, принадлежащие к остальным 13 семействам (CYPs 5, 7, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26, 27, 39, 46 и 51), метаболизируют не чужеродные соединения, а эндогенные липофильные субстраты, участвуя в таких физиологических реакциях, как синтез тромбоксанов, простациклинов, стероидных гормонов, желчных кислот и т.д (Hedlund Е. et al., 2001). При составлении номенклатуры не учитывались каталитическая активность и субстратная специфичность, поэтому представители различных подсемейств могут иметь одинаковую каталитическую активность и сходные функции (Nebert D.W., Gonzalez FJ.etal.,1991).
Важным свойством компонентов системы биотрансформации ксенобиотиков является их способность к индукции. Существуют конститутивные и индуцибельные цитохромы Р450. Конститутивные формы постоянно экспрессируются организмом, независимо от условий окружающей среды, и обнаруживаются в микросомах тканей интактных животных. Экспрессия индуцибельных ферментов регулируется индукторами-ксенобиотиками. Попадание такого вещества (индуктора) в организм может приводить к многократному увеличению общего количества цитохромов Р450 (Denison M.S., Whilock J.P., 1995). Многие формы цитохромов Р450 экспрессируются конститутивно и, кроме того, могут индуцироваться некоторыми ксенобиотиками (Gibson G.G., 1990). В качестве индукторов могут выступать субстраты соответствующих изоформ (Табл. 1).
Обычно индукция ферментов биотрансформации ксенобиотиков является благоприятной, так как позволяет организму эффективно элиминировать липофильные соединения и препятствовать их накоплению в клетках (Ma Q., 2001, Whitlock J.Р., 1999). Так как сами индукторы являются субстратами цитохромов Р450, индукция ограничена во времени. Такая индукция позволяет повышать и поддерживать уровень активности фермента только тогда, когда это необходимо. Однако, в ряде случаев индукция может иметь неблагоприятные последствия. Поскольку цитохромы Р450 обладают широкой субстратной специфичностью, то индукция одним субстратом может приводить к усилению метаболизма других веществ, в том числе и лекарственных препаратов, таким образом, изменяя их фармакокинетические свойства, терапевтический и токсический эффект. Также окисление некоторых субстратов цитохромом Р450 может приводить к образованию высокореакционноспособных электрофильных веществ, которые способны связываться с клеточными макромолекулами и обладают мутагенным, токсическим и канцерогенным действием (Ma Q., 2001; Whitlock J.P., 1999; McKinnon R.A., 2000).
Метаболизм витамина К
Витамин К (витамин коагуляции) был открыт в 1929 как компонент питания, необходимый для нормального свертывания крови. Содержание цыплят на синтетической диете с добавлением дрожжей в качестве источников витаминов Б и рыбьего жира, богатого витаминами А и Д, приводило к кровоизлияниям в ткани. Оказалось, что целебным эффектом обладают зерна злаков и другие растительные продукты. В 1939 из люцерны был выделен филлохинон, а из гниющей рыбной муки менахиноп (Колотилова А. И., Глушанков Е.П., 1976).
Витамин К является одним из немногих витаминов, для которых точно известна функция на молекулярном уровне. Это вещество является кофактором мембрапо-ассоциированной карбоксилазы, которая в присутствие С02 и 02, превращает глутаматные остатки в составе витамин К-зависимых белков в у-карбоксиглутаматные (Saxena S.P. et al., 2001; Vermeer С. et al., 1988). Кластер глутаматных остатков (GIa-регион) локализован на N-концевых участках этих белков; карбоксилируются 9-12 а.о., в зависимости от белка. Gla-регион опосредует Са -зависимое взаимодействие белков с анионными поверхностями и между собой.
Микросомальные ферменты: эпоксид-редуктаза и NADPH или NADH-зависимая хинон редуктаза превращают эпоксид в гидрохинон, который может использоваться в качестве кофактора повторно (Saxena S.P. et al., 2001; Suttie J.W., 1993). Цикл витамина редуктаза
Исторически первыми открытыми витамин К-зависимыми белками были факторы свертывания крови. Позже были идентифицированы костные белки, претерпевающие у-карбоксилирование (Ronden J.E., 1997). Исследования последних лет показали, что GAS6 и белок 6, способные влиять на многие клеточные события -клеточный рост, митогенез, трансформацию, выживание клеток, также содержат Gla-регионы. Это говорит о том, что витамин К может влиять на процессы развития опухолей, рост клеток, апоптоз (Saxena S.P., et al., 2001). Экспериментальные данные на этот счет противоречивы: большинство исследователей сходятся во мнении, что менадион может ингибировать рост опухолей (Israels L.G. et al., 1983; Wu F.Y. et al., 1993; Juan C.C., Wu F.Y., 1993), а филлохинон по одним данным - индуцирует (Israels L.G. et al., 1983), а по другим - ингибирует этот процесс (Wu F.Y. et al., 1993).
Помимо этого, витамины К участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, а также в биосинтезе микроорганизмами пиримидиновых оснований в анаэробных условиях. Не исключается их роль в процессах окислительного фосфорилирования в митохондриях животных (Колотилова А.И., Глушанков Е.П., 1976). In vitro показано антиоксидантное действие хиноновых форм витаминов группы К, эффективность которого равна 80% эффективности витамина Е в эквимолярной концентрации, и оксидантное - гидрохиноновых форм (Canfield L.M. et al., 1985; Johnson B.C., 1988).
Данные по влиянию витамина К на ферменты биотрансформации ксенобиотиков малочисленны и противоречивы. Содержание крыс на диете без витамина К приводило к повышению общего количества цитохромов Р450, а введение антивитамина К сопровождалось возрастанием содержания цитохрома Ь5 (Sokol nikov А.А., et al., 1992). Введение животным водорастворимого аналога витамина К - викасола усиливало биотрансформацию амидопирина и бензойной кислоты у крыс, при этом эффект дозы 3 мг/кг был более выражен, чем 30 мг/кг (Pentiuk А.А. et al., 1987). Добавление менадиона к микросомам печени крыс in vitro вызывало ингибирование анилин-р-гидроксилазной и аминопирин-1Ч-деметилазной активностей. В первом случае предположительным механизмом было замещение этим веществом цитохрома Р450 в субстратном центре NADPH-цитохром Р450 редуктазы, а во втором - ослабление связывания аминопирина с цитохромом Р450 (Floreani М., Carpendo F., 1990).
Показано, что в культурах клеток витамин К вызывает увеличение БП-гидроксилазной активности и специфической мРНК генов CYP1A в концентрации 4 мкг/мл, а концентрация 6 мкг/мл является цитотоксичной (Chen H.W., Ding J.H., 1987). С другой стороны, у сальмонел это вещество ингибирует 7-этокси- и 7-метоксирезоруфин-0-деэтилазные активности. (Edenharder R. et al., 1999). Введение витамина К] за сутки до введения бензо(а)пирена 17-дневым эмбрионам цыплят, сопровождалось увеличением БП-гидроксилазной активности и снижением активности ГСТ (Dogra S.C., Israels L.G., 1987). Витамин K3 у мышей понижал скорость метаболизма бензо(а)пирена (Israels L.G., et al., 1983).
В реконструированной системе, содержащей CYP1A1 крысы и NADPH-P450 редуктазу дрожжей, витамины К ингибировали 7-этоксикоумарин О-деэтилазную активность, частично опосредованную CYP1A1 (Inouye К. et al., 1999). Существуют данные о том, что добавление витамина К к микросомам интактных животных in vitro приводит к ингибированию метаболизма бензо(а) пирена за счет оттока электронов с цитохромов Р-450 (Byczkowski J.Z., Gessner Т., 1987). По данным других исследователей, витамин К в МХ-индуцированных микросомах вызывал увеличение БП-гидроксилазной активности, становясь дополнительным переносчиком электронов на цитохромы Р450 1А. Исследование спектра метаболитов БП в последнем случае показало, что менадион сильно ингибирует образование полярных соединений (Izotov M.V. et al., 1987).
Из представленного обзора литературных источников видно, что функции а-токоферола и менадиона гораздо шире, чем предполагалось ранее. Оба вещества используются в терапевтических целях, а их функции, несвязанные с антирадикальной и кровосвертывающей способностью, изучены слабо. Особенно важно исследование влияния а-токоферола и менадиона на ферменты биотрапсформации ксенобиотиков, поскольку они играют существенную роль в возникновении и развитии онкологических заболеваниий (CYP1A, ГСТ) и метаболизируют лекарственные препараты (CYP2). Существующие на сегодняшний день результаты исследований, посвященных данной проблеме, немногочисленны, противоречивы, и получены в основном либо на культурах клеток, либо с использованием генно-инженерных конструкций.
Исследование механизмов, лежащих в основе индукции активности CYP1A под действием менадиона и а-токоферола
Для исследования временной зависимости влияния менадиона крысам вводили 5% раствор менадиона в масле в дозе 30 мг/кг массы тела в сутки в течение 1, 4, 8, 12 и 17 суток. В таблице 6 представлены данные, характеризующие микросомальную монооксигеназную систему у контрольных и получавших менадион крыс породы Вистар. Введение менадиона в дозе 30 мг/ кг массы в течение 17 суток приводило к возрастанию в микросомах печени крыс количества цитохрома Ь5 в 1,6 раза, общего содержания цитохрома Р450 в 2 раза, активности НАДФН-цитохром с редуктазы в 1,9 раз по сравнению с контролем; при другом времени введения эти параметры не изменялись. Активность CYP1A1 возрастала на 4 сутки после введения менадиона в дозе 30 мг/кг в 1,6 раза и оставалась на том же уровне до 12 суток, еще более повышаясь на 17 сутки (в 3,2 раза). Активность CYP1A2 при введении менадиона возрастала в 2 раза на 4 сутки, оставалась повышенной в 1,8 раза на 8 сутки, а на 12 и 17 сутки достоверно не отличалась от значения в контрольной группе, хотя средние значения у экспериментальных животных были в 1.6 раза выше, чем у контрольных (Сидорова Ю.А. и др., 2004).
Поскольку при введении менадиона в течение 4-х суток наблюдалось явно выраженное увеличение активностей цитохромов Р450 подсемейства 1А, причем следующий прирост приходился только на 17 суток, а активность НАДФН-цитохром Р450 редуктазы не изменялась, это время было выбрано для исследования дозозависимых изменений активностей ферментов биотрансформации ксенобиотиков под действием менадиона.
Для изучения дозовой зависимости, менадион вводили в течение 4-х суток в дозах 1, 3, 7, 15и30 мг/кг массы тела в сутки. Полученные данные представлены в таблице 7.
Общее содержание цитохромов Р450 в микросомах печени крыс при введении 1-7 мг менадиона на кг массы тела в течение 4-х суток возрастало в 1,4, -1,5 раза, но не отличалось от контрольного при использовании доз 15 и .30 мг/кг массы. Активность НАДФН-цитохром Р450 редуктазы в микросомах достоверно не изменялась при использовании любых доз менадиона.
Активность CYP1A1 возрастала при введении 7, 15 и 30 мг менадиона на кг массы в 2,4, 5,4, и 2,4 раза по сравнению с контролем, соответственно; при использовании меньших доз менадиона достоверных отличий по этому параметру выявлено не было, хотя уже при дозе 3 мг/кг массы тела наблюдалась тенденция к повышению. Активность CYP1A2 при введении 7, 15 и 30 мг менадиона на кг массы возрастала в 2,3, 2,5 и 2,3 раза по сравнению с контролем, соответственно; при других дозах не отличалась от контрольного значения. Активность CYP2B1 повышалась при введении 7 и 15 мг менадиона на кг массы в 1,9 и 1,5 раза по сравнению с контролем, соответственно; во всех остальных случаях не отличалась от контрольного значения. Суммарная активность CYP2B и CYP2C возрастала при введении 7, 15 и 30 мг менадиона на кг массы тела в 6,9, 5,4 и 3,1 раза по сравнению с контролем. Активность глутатион-8-трансферазы возрастала при введении менадиона в дозе 1-15 мг на кг массы и возвращалась к контрольному уровню при введении дозы 30 мг на кг массы тела (Сидорова Ю.А. и др., 2004).
Таким образом, менадион способен индуцировать CYP1A, CYP2, НАДФН-цитохром Р450 редуктазу и ГСТ. Степень индукции CYP1A1 прямо пропорциональна длительности введения, активность CYP1A2 изменяется иным образоим: пик активности регистрируется в период от 4 до 8 суток, а к 17 суткам достоверных отличий от котроьного уровня не наблюдается.
Активность НАДФН-цитохром Р450 редуктазы не зависит от дозы, но возрастает при длительном введении (17 суток). Активности исследованных форм цитохрома Р450 изменяются в зависимости от дозы менади она: максимальная степень индукции для CYP1A регистрируется при введении 15 мг/кг, а для CYP2 - 7 мг/кг. Максимальная активность глутатион-8-трансферазы наблюдается при введении менадиона в дозе 1 мг/кг, а при дальнейшем увеличении дозы - уровень индукции снижатся.
Для характеристики антиоксидантных/прооксидантных свойств менадиона в микросомах печени крыс получавших разные дозы менадиона измеряли содержание конечного продукта перекисного окисления липидов - МДА. Полученные данные представлены в таблице 8.
Достоверных отличий в количестве МДА в микросомах печени контрольных и получавших менадион крыс обнаружено не было, хотя среднее значение этого показателя в группе, получавшей 15 мг менадиона/кг массы в сутки, было ниже, чем в контрольной. Следовательно, в исследованных дозах менадион не является ни антиокисдантом, ни прооксидантом.
Индуцирующий эффект а-токоферола на активности ферментов биотрансформации ксенобиотиков печени интактных крыс и механизмы, лежащие в основе индукции CYP1A
Проведенное нами исследование эффектов а-токоферола на ферменты биотрансформации ксенобиотиков печени экспериментальных животных показало, что его введение приводит к увеличению как общего содержания цитохромов Р450, так и специфических активностей отдельных форм Р450, принадлежащих к подсемействам 1А, 2В и 2С, а также активности второго компонента монооксигеназной реакции НАДФН-цитохром Р450 редуктазы и активности фермента второй фазы биотрансформации глутатион-Б-трансферазы. Все эти изменения имеют различные время- и дозо-зависимые закономерности, что свидетельствует о комплексности механизмов регуляции, лежащих в их основе.
Наши данные о повышении активностей CYP1A, определяемых по скорости метаболизма специфичных субстратов, под действием а-токоферола согласуются с данными исследований, проведенных на культурах клеток, в которых наблюдалось повышение скорости гидроксилирования бензо(а)пирена, частично-опосредованное CYP1A (-субстрата, менее специфичного для CYP1A) (Chen Y.T., Ding J.H., 1987), но отличаются от исследований, проведенных на животных, в которых наблюдали некоторое понижение БП-гидроксилазной активности в печени самцов крыс под действием витамина Е (Gairola С, Chen L.H., 1982). Наличие этого противоречия может объясняться разной длительностью введения исследуемого вещества. В работе Gairola Си Chen L.H. витамин Е вводили в течение 12 месяцев (Gairola С, Chen L.H., 1982) В нашей работе активность CYP1A максимально повышалась после однократной дозы в 150 мг/кг в течение первых суток, а увеличение продолжительности введения а-токоферола приводило к постепенному снижению этого показателя (с возвращением к контрольному уровню на 12 сутки).
Представленные результаты о повышении активности CYP2B1 при действии а-токоферола согласуются с данными других исследований, полученными на животных, содержащихся на диете с разным количеством а-токоферола и не противоречат данным, полученным при исследовании влияния дефицита а-токоферола на активность CYP2B1 (Lii С.К. et al., 1998, Cassand et al., 1993). Ранее было показано, что дефицит а-токоферола в питании сопровождается снижением НАДФН-редуктазной активности (Isotshyn V.M., 1998), а при введении этого витамина наблюдается повышение активности (Murray М., 1991), что соответствует полученным нами результатам.
Второй пик возрастания активностей CYP1A1, CYP2B1 и CYP2C, наблюдающийся при введении а-токоферола в дозе 300 мг/кг массы, после зарегистрированного снижения при дозе 150 мг/кг, может объясняться увеличением активности НАДФН-цитохром Р450 редуктазы, являющейся в ряде случаев скорость-лимитирующим фактором в монооксигеназных реакциях.
Что касается регуляции активностей CYP1A1 и 1А2 а-токоферолом, то механизм, был исследован нами подробно на уровне содержания мРНК, апоферментов и функциональной активности ферментов. Картина оказалась сложной. Анализ временных и дозо-зависимых закономерностей увеличения относительного содержания мРНК, апофермента и сопоставление этих параметров с активностью CYP1A1 показал, что индуцирующий эффект а-токоферола на транскрипционном уровне является краткосрочным, и в то же время зависит от дозы - чем выше доза тем быстрее исчезает вновь синтезированная РНК. Так, при дозе 150 мг а-токоферола/ кг массы тела экспрессия гена CYP1A1 увеличивается только в первые сутки. Если доза а-токоферола 30 мг/кг, то высокое относительное содержание мРНК сохраняется и через 4 суток, а при введении 70 мг/кг в течение 4 суток мРНК не выявляется вообще. Относительное содержание мРНК CYP1A2 под действием а-токоферола не изменяется, несмотря на увеличение активности фермента. Таким образом, можно считать установлеными механизмы индукции CYP1A при воздействии а-токоферола, которые в зависимости от дозы/времени введения реализуются как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях. Антиоксидантные способности а-токоферола могут объяснять посттранскрипционную индукцию CYP1A1, однако роль этих его свойств в транскрипционной индукции представляется маловероятной, поскольку соответствие между содержанием МДА в микросомах печени, активностью и уровнем синтеза мРНК CYP1A1 не наблюдается Для CYP1A1 AhR - зависимый путь индукции является единственным, доказанным на сегодняшний день (Whitlock J.P., 1999; Ma Q., 2001), хотя в литературе обсуждается существование других способов регуляции (Vecchini F. et al., 1994). CYP1A2 может индуцироваться как на транскрипционном уровне через AhR - зависимый (Gonzalez F.J. et al., 1985) или AhR - независимый пути сигнальной трансдукции (Jiang W. et al., 2004), так и на посттранскрипционном (Xu L.C., BresnickE, 1990). Результаты, полученные нами при исследовании ДНК-связывающей активности AhR и показавшие усиление связывания димера AhR/Arnt с XRE в экстрактах ядер клеток печени крыс, получавших а-токоферол, свидетельствуют о способности этого вещества активировать AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции. Рассматривая в целом полученные данные по влиянию а-токоферола на CYP1A1, можно предположить, что он способен увеличивать активность этого фермента разными способами. Во-первых, это активация транскрипции гена CYP1A1 через AhR-зависимый путь сигнальной трансдукции, наблюдаемая при коротких сроках введения большой дозы (150 мг/кг) и, вероятно, при более длительном введении, но малых доз а-токоферола. Во-вторых, это посттрансляционный механизм, вступающий в действие при увеличении дозы а-токоферола. а-Токоферол способен изменять физико-химические характеристики мембран, влияя таким образом на активность мембранно-связанных ферментов, в том числе и цитохромов Р450 (Hietanen Е. et al., 1975; Saito М. et al., 1990), а также может предотвращать повреждение ферментов, вызванное процессами перекисного окисления, за счет своих широко известных антиоксидантных способностей (Azzi A. et al., 2000), наблюдаемых и нами в данном исследовании. Возможно, оба этих свойства, или одно из них, объясняют повышение активности CYP1A при введении 70 мг а-токоферола на кг массы поскольку в этом случае не наблюдается ни увеличения уровня синтеза мРНК, ни возрастания содержания апофермента. Снижение экспрессии гена при этой дозе, а также обратная зависимость активности CYP1A1 от длительности введения а-токоферола, может свидетельствовать о его способности запускать механизм негативной транскрипционной регуляции этого гена при повышении содержания а-токоферола в тканях.
Хотя а-токоферол изучался ранее в основном как антиокисдант, исследования последнего десятилетия выявили некоторые другие его функции в клеточном метаболизме, не связанные с антирадикальной активностью (Azzi A. et al., 2000; Birgelius-Flohe R., Traber M.G., 1999). Показано, что сс-токоферол способен изменять экспрессию некоторых генов и модулировать активности некоторых ферментов на посттранскрипционном уровне, в частности, ингибировать протеин киназу С (Boscoboinik D. et al, 1991; Ricciarelli R. et al., 1998), которая, судя по литературным данным, играет важную роль в регуляции AhR-зависмого пути сигнальной трансдукции (Long W.P. et al., 1998; Chen Y.H., Tukey R.H., 1996). Возможно, высокие концентрации а-токоферола могут супрессировать экспрессию гена CYP1A1, снижая степень фосфорилирования AhR и/или Arnt.
