Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
2.1. Семейство натрийуретических пептидов 11
2.1.1. Открытие натрийуретических пептидов 11
2.1.2. Натрийуретический пептид В-типа — представитель семейства натрийуретических пептидов 12
2.2. Синтез и секреция BNP 14
2.2.1. Структура гена BNP 14
2.2.2. Экспрессия BNP в различных тканях 14
2.2.3. Регуляция секреции и экспрессии BNP 15
2.3. Процессинг молекул-предшественников BNP 17
2.3.1. Семейство конвертаз прогормонов 17
2.3.2. Экспрессия и процессинг молекул-предшествинников BNP 18
2.3.3. Фурин и корин — потенциальные конвертазы, осуществляющие процессинг молекул-предшественников BNP 19
2.4. Посттрансляционные модификации proBNP и NT-proBNP 23
2.4.1. Представления о существовании олигомерных форм proBNP и NT-pro BNP 23
2.4.2. ProBNP и NT-proBNP как О-гликопротеины 24
2.4.3. О-гликозилирование — наиболее распространенный тип посттрансляционных модификаций белков 26
2.5. Рецепторы натрийуретических пептидов 28
2.5.1. Семейство рецепторов натрийуретических пептидов 28
2.5.2. Активация и десенситизация рецепторов 30
2.6. Метаболизм BNP в кровотоке 32
2.7. Физиологическое действие BNP 34
2.7.1. Действие BNP на почки 34
2.7.2. Действие BNP на сердечно-сосудистую систему 34
2.7.3. Действие на эндокринную систему 35
2.8. BNP — диагностический и прогностический биохимический маркер состояния
сердечной недостаточности 35
2.8.1. Сердечная недостаточность. Общая характеристика 35
2.8.2. Патофизиология СН 37
2.8.3. Терапевтическое применение натрийуретических пептидов 38
2.8.4. Диагностика СН 41
2.8.5. Измерение концентрации BNP и NT-proBNP в крови 44
2.9. Процессинг молекул-предшественников BNP — возможный регуляторный механизм содержания активной формы BNP в крови 46
2.9.1. Формы BNP в крови 46
2.9.2. ProBNP - превалирующая форма в крови больных с СН 48
2.9.3. Эндокринный парадокс 49
3. Материалы и методы 51
3.1. Материалы 51
3.1.1. Реактивы и материалы для биохимических и молекулярно-биологических исследований 51
3.1.2. Реактивы и материалы для клеточно-биологических исследований 52
3.2. Методы исследования 53
3.2.1. Иммунохимические и биохимические методы 53
3.2.1.1. Прямой гшмуноанализ и иммуноанализ сэндвич-типа. Общие принципы .53
3.2.1.2. Коныогирование антител 55
а) Конъюгирование антител с пероксидазой хрена 55
б) Конъюгирование антител со стабильным хелатом европия 57
в) Конъюгирование антител с производным биотина 58
3.2.1.3. Прямой иммупоферментный анализ 58
3.2.1.4. Прямой иммупофосфоресцентный анализ 59
3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа 59
3.2.1.5. Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа с направленной сорбцией антител на планшете 60
3.2.1.6. Иммобилизация антител на CNBr — активированной сефарозе 60
3.2.1.7. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН в трис-трициновой буферной системе 62
3.2.1.8. Вестерн-блоттинг 63
3.2.1.9. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране 63
а) Визуализация белковых полос с помощью хромогенного субстрата диаминобензидина 64
б) Визуализация белковых полос с использованием метода усиленной хемилюминесценции (Enhanced Chemioluminescence, ECL) 64
3.2.1.10. Экстракция и иммунопреципитация proBNP с использованием аффинного носителя 64
а) Экстракция proBNP из объединенной плазмы больных СН 64
б) Экстракция рекомбинантного proBNP из объединенной кондиционированной среды 65
в) Микроэкстракция proBNP методом аффинной хроматографии 65
г) Иммунопреципитация proBNP 65
3.2.1.11. Хроматографическое разделение белков 66
а) Ионообменная хроматография 66
б) Гель-фильтрация 67
в) Обратно-фазовая хроматография 67
3.2.1.12. Ферментативное дегликозилирование proBNP 67
3.2.1.13. Химическое дегликозилирование рекомбинантного proBNP, экспрессированного в клетках НЕК 293 68
3.2.1.14. Расщепление proBNP рекомбинантным фурином in vitro 69
а) Расщепление рекомбинантного proBNP 69
б) Расщепление эндогенного proBNP 69
3.2.1.15. Масс-спектрометрический анализ 69
3.2.2. Молекулярно-биологические методы 70
3.2.2.1. Получение молекулярно-генетической конструкцииpCMV/proBNP для экспрессии рекомбинантного proBNP в клетках млекопитающих 70
3.2.2.2. Получение молекулярно-генетических конструкций для экспрессии мутантиых форм proBNP. 70
3.2.3. Клеточно-биологические методы 71
3.2.3.1. Культивирование клеточных линий НЕК 293, СНО-К1, NIH ЗТЗ 71
3.2.3.2. Транзиторная трансфекция эукариотических клеточных линий 71
CLASS 4. Результаты исследования и их обсуждение 7 CLASS 4
4.1. Сравнение профилей иїимунореактивности эндогенных proBNP и NT-proBNP 74
4.2. Создание молекулярно-генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного proBNP в линиях клеток млекопитающих 81
4.3. Экспресиия rec-proBNP в клеточной линии НЕК 293 82
4.3.1. Оценка уровня экспрессии rec-proBNP 82
4.3.2. Определение оптимального времени культивирования клеток НЕК 293 после
проведения трансфекции 85
4.3.3. Анализ форм rec-proBNP в кондиционированной среде клеток линии НЕК 293, трансфицированных конструкцией pCMV/proBNP 86
4.4. Степень гликозилирования участка 63-76 rec-proBNP и уровень процессинга 88
4.4.1. Иммунореактивностъ rec-proBNP и rec-NT-proBNP, экспрессированных в клеточных линиях СНО-К1 и NIH ЗТЗ 88
4.4.2. Уровень процессинга rec-proBNP при экспрессии в клеточных линиях НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ 90
4.5. Получение очищенного препарата rec-proBNP, экснрсссированного в клеточной линии НЕК 293 92
4.5.1. Выделение и очистка rec-proBNP (НЕК 293) 92
4.5.2. Характеризация очищенного препарата rec-proBNP (НЕК 293) 93
4.6. Влияние гликозилирования участка, расположенного вблизи сайта
процессинга, на расщепление proBNP конвертазой прогормонов фурином 97
4.6.1. Расщепление rec-proBNP, экспрессированного в клетках НЕК293, рекомбинантнъш фурином 97
4.6.2. Расщепление эндогенного proBNP рекомбинантнъш фурином 100
4.7. Процессинг мутантных форм rec-proBNP (НЕК 293) 103
4.7.1. Сканирующийаланиновыймутагенез 103
4.7.2. Оценка уровня процессинга мутантных форм rec-proBNP... 104
4.7.3. Исследование процессинга rec-proBNP дикого типа и формы Т71А с использованием метода гель-фильтрации 106
4.7.4. Исследование BNP, образующегося при процессинге мутантной формы гес-proBNP Т71А, с использованием метода масс-спектрометрии 107
4.8. Анализ филогенетической консервативности феномена ингибирования процессинга proBNP под действием гликозилирования 108
Заключение ПО
Выводы 112
Благодарности ИЗ
Список цитируемой литературы 114
- Фурин и корин — потенциальные конвертазы, осуществляющие процессинг молекул-предшественников BNP
- Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа с направленной сорбцией антител на планшете
- Культивирование клеточных линий НЕК 293, СНО-К1, NIH ЗТЗ
- Расщепление rec-proBNP, экспрессированного в клетках НЕК293, рекомбинантнъш фурином
Введение к работе
Актуальность проблемы. Натрийуретический пептид В-типа (BNP) является циркулирующим в крови пептидным гормоном. Физиологическое действие BNP проявляется в регуляции объема жидкости организма и кровяного давления. BNP стимулирует натрийурез и диурез, обладает сосудорасширяющим действием, оказывает ингибирующее действие на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему.
BNP синтезируется преимущественно кардиомиоцитами. Подобно многим другим
биологически активным пептидам, BNP синтезируется в виде
молекул-предшественников, процессинг которых приводит к образованию активного гормона. У человека молекула-предшественник, proBNP, состоит из 108 аминокислотных остатков (а.к.о.). Фрагмент, соответствующий по последовательности BNP, состоит из 32 а.к.о. и расположен в С-концевой части молекулы proBNP. В результате процессинга происходит образование двух полипептидов - физиологически активного гормона BNP и N-концевого фрагмента, NT-proBNP, состоящего из 76 а.к.о., для которого физиологическая активность не показана.
При заболеваниях сердечно-сосудистой системы, связанных с повышением давления на стенки камер сердца, концентрация BNP и NT-proBNP в крови значительно повышается, при этом наблюдается положительная корреляция между концентрацией полипептидов и степенью тяжести заболевания. В настоящее время измерение концентрации BNP и NT-proBNP в крови с применением иммунохимических методов широко используется в клинической практике для диагностики сердечной недостаточности (СН), оценки функции левого желудочка, прогнозирования риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, мониторинга терапии СН.
СН - патофизиологическое состояние, вызванное ухудшением сократительной способности сердца, сопровождается увеличением уровня экспрессии и секреции BNP. На ранних стадиях развития СН повышение концентрации BNP в крови обеспечивает регуляцию функционирования сердечно-сосудистой системы и почек. Однако у больных с тяжелыми формами СН даже на фоне очень высоких значений концентрации BNP, определяемых в крови с использованием иммунохимических методов, наблюдается удержание воды и натрия, повышенное системное сосудистое сопротивление и высокие значения преднагрузки сердца. Сравнительно недавно в нашей лаборатории, а позднее и рядом других исследовательских групп, было показано, что высокий уровень иммунореактивного BNP в крови больных с тяжелыми формами СН отражает прежде всего содержание proBNP, а не BNP, как считалось ранее. При этом концентрация
proBNP в крови больных с СН может в несколько раз превышать концентрацию физиологически активного гормона, BNP.
На основании этих данных в литературе высказывается предположение, что у больных с тяжелыми формами СН может развиваться состояние недостаточности физиологически активного гормона на фоне высокого содержания в крови предшественника - proBNP. Поскольку BNP образуется в результате процессинга proBNP, причиной недостаточности физиологически активного гормона в крови могут быть нарушения процессинга молекул-предшественников. Однако даже предположить, на каком этапе происходит нарушение, достаточно сложно, так как молекулярные механизмы процессинга proBNP в настоящее время практически не изучены.
В данной работе в качестве возможного механизма регуляции процессинга proBNP рассматривается гликозилирование аминокислотных остатков, расположенных рядом с сайтом процессинга. Предположение о возможном влиянии гликозилирования на процессинг proBNP было высказано в нашей лаборатории на основании данных, полученных в недавних исследованиях. Было показано, что NT-proBNP и proBNP, циркулирующие в крови больных с СН, являются О-гликопротеинами. Для рекомбинантного proBNP, экспрессированного в линии клеток млекопитающих СНО (клетки яичника китайского хомяка), Schellenberger и соавторы идетифицировали 7 сайтов гликозилирования: Т36, S37, S44, Т48, S53, Т58 и Т71 (Schellenberger et al. 2006). В нашей лаборатории было показано, что центральный участок (28-56 а.к.о.) эндогенного NT-proBNP гликозилирован, тогда как N- и С-концевые фрагменты молекулы не содержат углеводных остатков (Seferian et al. 2008). Наличие гликозилирования у непроцессированного предшественника (proBNP) на участке, расположенном рядом с сайтом расщепления -R76slS77- (потенциальный сайт гликозилирования - T7i), и отсутствие гликозилирования по данному сайту у процессированного фрагмента (NT-proBNP) позволило предположить, что:
гликозилирование молекулы proBNP на участке вблизи сайта расщепления оказывает негативное влияние на процессинг;
гликозилирование может быть частью регуляторного механизма процессинга proBNP.
Таким образом, целью данной работы было исследование возможного механизма регуляции процессинга proBNP, основанного на гликозилировании фрагмента молекулы, расположенного рядом с сайтом процессинга.
Задачи исследования:
Провести сравнительное исследование профилей гликозилирования proBNP и NT-proBNP, циркулирующих в крови больных с СН.
Разработать метод экспрессии рекомбинантного proBNP в линиях клеток млекопитающих. Выбрать модельную систему для исследования влияния гликозилирования на процессинг proBNP.
Разработать метод получения и очистки препарата рекомбинантного proBNP, экспрессированного в линии клеток млекопитающих. Охарактеризовать иммунохимические и биохимические свойства очищенного препарата рекомбинантного proBNP.
Исследовать влияние гликозилирования на процессинг рекомбинантного и эндогенного proBNP in vitro под действием конвертазы прогормонов фурин.
Исследовать сайт-специфичность процессинга proBNP под действием фурина.
Создать молекулярно-генетические конструкции для экспрессии мутантных форм proBNP, содержащих замены остатков серина и треонина, расположенных в непосредственной близости от сайта процессинга, на остатки аланина. Провести исследования эффективности процессинга полученных мутантных форм proBNP.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе с использованием широкого набора иммунохимических, биохимических и молекулярно-биологических методов впервые показано, что эффективность процессинга proBNP человека зависит от статуса гликозилирования участка молекулы, расположенного в непосредственной близости от сайта расщепления. В экспериментах с очищенными препаратами рекомбинантного и эндогенного proBNP было показано, что гликозилирование данного участка препятствует расщеплению proBNP конвертазой фурин. Исследование эффективности процессинга различных мутантных форм proBNP, экспресированных в линии клеток человека, позволило установить, что наличие О-гликанов, ковалентно связанных с остатком треонина в положении 71, препятствует прохождению процессинга proBNP.
Результаты, полученные в данной работе, значительно расширяют современные
представления о молекулярных механизмах процессинга молекулы-предшественника BNP. Показанное в данной работе негативное влияние гликозилирования на процессинг proBNP позволяет объяснить накопление молекул-предшественников в крови больных с тяжелыми формами СН за счет снижения уровня процессинга на фоне повышенного уровня гликозилирования.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, на 34 конгрессе Союза Европейских Биохимических Сообществ в 2009 году (Прага, Чехия), съездах Американской Ассоциации Клинической Химии в 2009 (Чикаго, США), 2008 (Вашингтон, США), в 2007 году (Сан-Диего, США), на XXXI Конгрессе Клинической Химии в 2008 году (Хельсинки, Финляндия), на четвертой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения в 2008 году (Москва, Россия), на Международной конференции "Биотехнология и медицина" в 2007 году (Москва, Россия) и на Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2006 году (Москва, Россия). Результаты, представленные в виде стендового и устного докладов на съезде Американской Ассоциации Клинической Химии в 2008 году, были отмечены наградой Американской Национальной Ассоциации Клинической Биохимии.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 4 статьи в профильном журнале.
Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, список цитированной литературы. Работа изложена на 130 страницах печатного текста, иллюстрирована 43 рисунками и 3 таблицами. Список цитированной литературы содержит 191 наименование.
Фурин и корин — потенциальные конвертазы, осуществляющие процессинг молекул-предшественников BNP
До настоящего времени не установлено, какая именно конвертаза прогормонов осуществляет процессинг proBNP. Также неизвестно, на каком этапе секреторного пути происходит процессинг. В качестве возможных конвертаз, осуществляющих процессинг proBNP, в настоящее время в литературе обсуждаются две сериновые протеазы, фурин и корин.
Конвертаза прогормонов фурин (3.4.21.75) представляет собой Са2+-зависимую внутриклеточную сериновую эндопротеазу, принадлежащую к семейству субтилизиновых конвертаз прогормнонов. Фурин является мембранным белком I типа, локализован в транс-Гол ьджи сети. Существуют также данные, указывающие на то, что фурин способен циркулировать между транс-Гольджи сетью и плазматической мембраной. Также показано, что фурин может присутствовать на поверхности плазматической мембраны. Экспрессия фурина показана для многих тканей и большинства известных клеточных линий. Участие фурина в процессинге молекул-предшественников показано для многих гормонов, факторов роста, рецепторов, матриксных металлопротеиназ, белков плазмы, белков патогенных бактерий и вирусов (Nakayama 1997).
Фурин, как и другие конвертазы прогормонов субтилизинового семейства, является мультидоменным белком. Фурин человека экспрессируется в виде неактивного предшественника, состоящего из 794 а.к.о. Предшественник фурина содержит сигнальный пептид (24 а.к.о.) и последовательность пропептида (83 а.к.о.). В структуре фурина выделяют субти лизин подобный каталитический домен (337 а.к.о.), центральный Р-домен {133 а.к.о.), цистеин-богатый домен, содержащий 12 остатков цистеина, трансмембранный домен (21 а.к.о.) и С-концевой цитоплазматический домен (58 а.к.о.) (Рис. 4).
Показано, что для осуществления процессинга под действием фурина необходимым и достаточным условием является наличие в последовательности субстрата в положениях -1 и -4 в направлении N-конца от сайта расщепления остатков аргинина, тогда как остатки в положениях -2 и -3 не так важны для осуществления процессинга под действием фурина (Molloy et al. 1992). Таким образом, фурин способен осуществлять процессинг белков, содержащих последовательность -R-X-X-R-J , где X — любой а.к.о. При наличии в последовательности субстрата в положении -2 от сайта процессинга положительно заряженных АК, лизина или аргинина, процессинг под действием фурина проходит с большей эффективностью. Также показано, что фурин способен осуществлять процессинг белков, содержащих последовательность вида -K/R-X-X-X-K/R-R-J , в которой отсутствует остаток аргинина в положении -4, но есть положительно заряженные а.к.о. (лизин/аргини) в положениях -2 и -6 (Nakayama 1997).
Последовательность proBNP человека содержит мотив -R73-A-P-R76-, удовлетворяющий условию -R-X-X-R-, непосредственно перед сайтом, по которому происходит процессинг молекул proBNP (-R76 S77-)- Наличие характерной последовательности вблизи сайта процессинга и тот факт, что экспрессия фурина была показана в кардиомиоцитах, позволили предположить, что процессинг proBNP в кардиомиоцитах происходит именно под действием конвертазы фурин. На потенциальную функциональную связь фурина и proBNP указывает ряд данных. На культуре кардиомиоцитов крысы было показано, что развитие гипертрофии сердца, вызванной растяжением, имитирующим повышение давления на стенки камер сердца, сопровождается одновременным увеличением уровня экспрессии мРНК BNP и фурина (Sawada et al. 1997b). Однако при добавлении ингибиторов фурина в культуральную среду растяжение не приводило к гипертрофическому росту кардиомиоцитов, при этом также наблюдалось ингибирование процессинга proBNP. В другом исследовании на экспериментальной модели инфаркта миокарда у крыс было показано, что изменение уровня экспрессии BNP положительно коррелировало с изменением уровня экспрессии фурина. Кроме того, с использованием иммуногистохимических методов была показана колокализация proBNP и фурина в области, близкой к очагу инфаркта (Sawada et al. 1997а).
Потенциальная способность фурина осуществлять процессинг proBNP была показана в экспериментах in vitro с использованием рекомбинантных фурина и proBNP. Giuliani и соавторы показали, что добавление рекомбинантного фурина к образцу, содержащему рекомбинантный proBNP, приводило к расщеплению proBNP с образованием BNP и NT-proBNP (Giuliani et al. 2006). Косвенные данные, указывающие на потенциальное участие фурина в процессинге proBNP, были получены в исследовании, проведенном Wu и соавторами (Wu et al. 2003). В этом исследовании было показано, что фурин способен осуществлять процессинг молекул-предшественников CNP, proCNP. Прохождение процессинга proCNP под действием фурина возможно благодаря наличию в последовательности proCNP участка -R47-L-L-R50-. Потенциальный участок узнавания конвертазой прогормонов в последовательности proBNP, -R73-A-P-R76-, имеет близкую структуру, что позволяет предположить участие фурина и в процессинге proBNP.
Как уже упоминалось выше, помимо фурина в литературе обсуждается участие в процессинге proBNP относительно недавно открытой сериновой протеазы корин. Было показано, что протеаза корин экспрессируется в сердце; экспрессия корин в других органах и тканях не была обнаружена (Yan et al. 1999). На основании известной аминокислотной последовательности было предсказано, что корин является трансмембранным белком II типа, относящимся к семейству сериновых трансмембранных протеаз, с коротким цитоплазматическим доменом и большим внеклеточным доменом, содержащим трипсино-подобный каталитический домен. Позднее экспериментально было подтверждено, что корин действительно является трансмембранным белком плазматической мембраны, и показано, что расщепление субстрата происходит на поверхности клеток (Yan et al. 2000; Gladysheva et al. 2008).
Корин человека состоит из 1042 а.к.о. Подобно большинству трипсино-подобных протеаз, корин экспрессируется в виде неактивного зимогена. Показано, что для активации Корина необходима стадия протеолитического расщепления по сайту -RsoiJ IgcG-- При этом каталитический домен после стадии протеолитического расщепления остается связанным с пропептидом посредством дисульфидной связи (Рис. 5). Протеаза, осуществляющая протеолиз зимогена с образованием активной формы Корина, до сих пор не обнаружена (Liao et al. 2007).
Иммунофосфоресцентный анализ сэндвич-типа с направленной сорбцией антител на планшете
Принцип метода активации сефарозы с помощью бромциана (CNBr) основан на способности бромциана в водном растворе взаимодействовать с гидроксильными группами сефарозы. Результатом взаимодействия CNBr с двумя соседними гидроксильными группами через неустойчивый промежуточный цианат является образование активного имидокарбоната, содержащего электрофильный атом углерода, и неактивного карбамата. При взаимодействии имидокарбоната с нуклеофильными группами, прежде всего с є-аминогруппами лизина, происходит образование ковалентной связи белка с активированной матрицей через остаток изомочевины или N-замещенного карбамата. Схема реакции представлена на Рис. 17.
Реакция активации идет только в сильно щелочной среде (рН 10,5-11,0), которая непрерывно закисляется освобождающейся бромистоводородной кислотой. Поэтому при проведении реакции активации требуется постоянное добавление щелочи к реакционной смеси или использование достаточно емкого щелочного буфера. Сильно щелочная среда необходима для частичной ионизации гидроксильных групп (рКа « 12) (Остерман 1985). Иммобилизацию антител на BrCN-активированной сефарозе проводили по следующей методике.
Подготовка антител. Для проведения реакции антитела переводили в бикарбонатный буфер, содержащий 0,1 М NaHCCb, 0,5 М NaCl, рН 8,3 методом диализа. Активация сефарозы. Предварительно сефарозу CL-4B отмывали на воронке со стеклянным фильтром 20 объемами дистиллированной воды от компонентов буфера хранения и суспендировали в 2 объемах холодной дистиллированной воды. Затем доводили рН в суспензии сефарозы до значения 12,0, добавляя при постоянном перемешивании концентрированный раствор NaOH. После этого к суспензии по каплям добавляли раствор CNBr в ацетонитриле с концетрацией 1 г/мл из расчета 1 г CNBr на 10 мл сефарозы. Реакцию активации проводили в течение 30 мин на снегу, так как реакция бромциана с гидроксильными группами сефарозы экзотермична. При этом рН реакционной смеси поддерживали на уровне 10,0 - 11,0, добавляя концентрированный раствор NaOH. Об окончании реакции свидетельствует прекращение закислення реакционной смеси. Затем сефарозу промывали 10 объемами холодной дистиллированной воды и 20 объемами холодного бикарбонатного буфера.
Сразу после отмывки сефарозы бикарбонатным буфером к ней добавляли раствор антител в этом же буфере из расчета 5 мг антител на 1 мл носителя. Инкубацию проводили в течение 1 часа при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Затем носитель инкубировали в 1 М растворе этаноламина, рН 8,2, в течение 1 часа при тех же условиях для блокирования оставшихся активных групп. Сефарозу с иммобилизованными антителами последовательно отмывали на воронке со стеклянным фильтром сначала 10 объемами 0,1 М глицинового буфера, рН 2,0, а затем таким же объемом ФСБ. Полученный аффинный носитель хранили в ФСБ, содержащем 0,1% NaN3, при температуре 4 С.
Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН в трис-трициновой буферной системе
Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН в трис-трициновой буферной системе представляет собой модифицированный метод электрофореза по Лэммли (Laemmli 1970). В буферной системе, предложенной Schiigger и соавторами, в качестве замыкающего иона вместо глицина используется трицин, что позволяет добиться лучшего разрешения белковых полос, особенно при разделении компонентов с молекулярными массами от 2-3 до 20 кДа (Schagger and von Jagow 1987).
В данной работе мы использовали разделяющий гель с Т = 16,5%, и С = 3% и концентрирующий гель с Т = 4% и С = 3%, где Т — это общее процентное содержание акриламида и метиленбисакриламида, а С — отношение метиленбисакриламида к общему содержанию акриламида и метиленбисакриламида. Между разделяющим и концентрирующим гелями для лучшего разделения пизкомолекулярных белков помещали промежуточный гель с Т = 10% и С = 3%. Гели готовили на буфере, содержащем 3,0 М Трис-HCl, рН 8,45, 0,3% ДСН. Конечная концентрация компонентов буфера в разделяющем и промежуточном гелях составляла 1,0 М Трис-HCl, рН 8,45, 0,1% ДСН, для концентрирующего геля конечная концентрация компонентов буфера составляла 0,75 М Трис-HCl, рН 8,45, 0,075% ДСН. В качестве катодного буфера использовали буфер, содержащий 0,1 М Трис, 0,1 М Трицин, рН 8,25, 0,1% ДСН. В качестве анодного буфера использовали буфер, содержащий 0,2 М Трис-HCl, рН 8,9. Схема проведения электрофореза в трис-трициновой буферной системе представлена на Рис. 18.
Перед нанесением в лунки геля исследуемые образцы смешивали в соотношении 3:1с буферным раствором, содержащим 0,25 М трис-HCl, рН 6,8, 8% ДСН, 40% глицерин, 10% Р-меркаптоэтанол, 0,1% бромфеноловый синий (буфер для приготовления образцов) и инкубировали при температуре 100 С в течение 5-15 мин. Электрофоретическое разделение проводили при постоянном напряжении 150 В в течение 2,5 часов. Гели окрашивали 0,25% раствором Кумасси R-250 в 50% этаноле и 7% уксусной кислоте.
Культивирование клеточных линий НЕК 293, СНО-К1, NIH ЗТЗ
Клеточные линии НЕК 293, СНО-К1 и NIH ЗТЗ культивировали в ростовой среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 40 мкг/мл гентамицина, при температуре 37 С в СОг-инкубаторе (парцильное давление СОг составляло 5%) в соответствии со стандартными протоколами АТСС (http://www.atcc.org). При достижении 80-90% конфлюентного монослоя клетки пересевали. Для этого клетки промывали ФСБ для удаления сывороточных белков среды, после чего инкубировали 3-5 мин при 37 С в 0,25% растворе трипсина, затем протеолитическую активность трипсина ингибировали добавлением среды DMEM с 10% ЭТС. После этого клетки суспендировали» и необходимую часть суспензии переносили в планшеты или культуральные флаконы с ростовой средой DMEM, содержащей 10% ЭТС и продолжали растить клетки до достижения необходимой плотности.
Культуру клеток хранили в замороженном виде в жидком азоте. Для замораживания культуру клеток обрабатывали 0,5% раствором трипсина и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 800 g; супернатант удаляли, а осадок суспендировали в среде для заморозки DMEM, содержащей 30% ЭТС и 10% DMSO. Клетки суспендировали из расчета 5 млн клеток в 1 мл среды. После этого клеточную суспензию переносили в ампулы и выдерживали 24 часа при -70С. Затем ампулы переносили в жидкий азот.
Термин трансфекция подразумевает внедрение чужеродного генетического материала в эукариотические животные клетки с использованием различных способов доставки чужеродной ДНК (вирусные векторные системы, электропорация, тепловой шок, магнетофекция, поликатионные липиды). В настоящее время метод трансфекции широко применяется в исследованиях, так как позволяет осуществлять избирательную экспрессию белка в различных типах клеточных культур. По продолжительности внедрения чужеродной ДНК в клетку различают 2 типа трансфекции: временную и постоянную. При временной трансфекции чужеродная ДНК не передается дочерней клетке при митозе. Селективный отбор, использующийся в методе постоянной трансфекции, позволяет отобрать клетки со встроенной в геном чужеродной ДНК. В данной работе для осуществления экспрессии рекомбинантного proBNP был использован метод временной трансфекции.
Для проведения трансфекции мы использовали реагент унифектин-56, представляющий собой смесь поликатионных липидов. Принцип метода трансфекции с помощью поликатионных липидов основан на способности поликатионных липидов формировать липосомы, связывающие отрицательно заряженные молекулы ДНК. Липосомы проникают внутрь клеток, сливаясь с плазматической мембраной, высвобождая при этом молекулы ДНК внутрь клетки. После этого молекулы ДНК проникают в клеточное ядро (Рис. 21).
Схема проведения трансфекции с использованием поликатионных липидов. Слияние комплекса ДНК/поликатионлыс липиды с плазматической мембраной
Трансфекцию клеток с использованием трансфекционного реагента унифектин-56 проводили по протоколу для проведения временной трансфекции прикрепляющихся клеток, прилагаемому производителем. Трансфекцию клеток проводили при достижении клетками 90-95% конфлюентности. Смену ростовой среды проводили через 24 часа после проведения трансфекции. 4. Результаты исследования и их обсуждение
В 2006 г. в исследовании, проведенном Schellenberger и соавторами, было показано, что эндогенный proBNP, циркулирующий в крови больных СН, представляет собой О-гликопротеин (Schellenberger et al. 2006). Этой исследовательской группой для рекомбинантного proBNP, экспрессированного в линии клеток млекопитающих СНО, были определены 7 сайтов гликозилирования: Тзб, S37, S44, Т48, S53, Т58 и Т71, среди которых сайт гликозилирования по остатку треонина в положении 71 (Т71) расположен вблизи сайта процессинга молекул proBNP -R76iS 77-.
Процессинг proBNP приводит к образованию N-концевого фрагмента NT-proBNP (1-76 а.к.о.) и физиологически активного гормона BNP (77-108 а.к.о.). Поскольку NT-proBNP образуется в результате процессинга молекул proBNP, можно было бы ожидать, что по характеру гликозилирования и расположению сайтов гликозилирования NT-proBNP должен соответствовать proBNP. Однако это предположение противоречит данным, полученным ранее в нашей лаборатории при исследовании эндогенного NT-proBNP из крови больных СН (Seferian et al. 2008). Как было показано Seferian и соавторами, у эндогенного NT-proBNP так же, как и рекомбинантного proBNP, N-концевые фрагменты (1-24 а.к.о.) не содержат углеводных остатков, в то время как центральная часть (28-56 а.к.о.) обоих белков гликозилирована. Однако в отличие от рекомбинантного proBNP, С-концевой (61-76 а.к.о.) участок эндогенного NT-proBNP либо вообще не содержит ковалентно связанных углеводных остатков, либо гликозилирован в значительно меньшей степени, чем центральная часть. Наличие гликозилирования на участке, расположенном рядом с сайтом расщепления -R.76 S77-, У непроцессированного предшественника, показанное в случае рекомбинантного proBNP, и отсутствие гликозилирования по данному сайту у эндогенного процессированного фрагмента (NT-proBNP) позволило нам выдвинуть гипотезу о негативном влиянии гликозилирования молекулы proBNP на участке вблизи сайта расщепления на процессинг и о существовании возможного регуляторного механизма процессинга proBNP, связанного с гликозилированием.
Расщепление rec-proBNP, экспрессированного в клетках НЕК293, рекомбинантнъш фурином
Как уже отмечалось ранее, выбор в качестве модельной системы rec-proBNP (НЕК 293) для исследования влияния гликозилирования участка, расположенного вблизи сайта процессинга, на процессинг proBNP был обусловлен тем, что для белка, экспрессируемого в клетках НЕК 293, был показан наибольший среди 3 исследованных клеточных линий уровень гликозилирования участка 63-76 (Рис. ЗЗА). В разделе "Обзор литературы" было отмечено, что в настоящее время не установлено, какая именно конвертаза прогормонов осуществляет процессинг молекул proBNP. В качестве возможных кандидатов рассматриваются две конвертазы прогормонов, фурин и корин. Конвертаза прогормонов фурин хорошо изучена, для нее показана экспрессия во многих тканях и клеточных линиях, включая клеточную линию НЕК 293 (Nakayama 1997; Wu et al. 2003). Так, одновременное изменение уровня экспрессии фурина и proBNP в кардиомиоцитах крысы при развитии инфаркта может указывать на возможную функциональную связь этих двух белков (Sawada et al. 1997а). Также на неонатальных кардиомиоцитах крысы было показано ингибирование процессинга proBNP под действием фурин-специфичных ингибиторов (Sawada et al. 1997b). Кроме того, было показано, что рекомбинантный фурин способен эффективно расщеплять rec-proBNP (Е. coll) (Giuliani et al. 2006). С другой стороны, данные, указывающие на участие относительно недавно открытой конвертазы корин в процессинге proBNP не столь убедительны,(Wu et al. 2003). В данной работе в качестве кандидата на роль потенциальной конвертазы, осуществляющей процессинг proBNP, мы рассматривали конвертазу фурин.
Как уже отмечалось ранее, необходимым и достаточным условием для расщепления фурином является наличие в последовательности субстрата остатков аргинина в положении Р1 и Р4 (положения аминокислотных остатков в сторону N-конца от сайта процессинга) (Molloy et al. 1992). Последовательность proBNP вблизи сайта процессинга удовлетворяет этому условию: TILRTSAPR STT- (P1=R76 И P4=R73).
Исследование влияния гликозилирования участка, расположенного в непосредственной близости от сайта процессинга, на процессинг proBNP под действием конвертазы фурин мы проводили с использованием полученного ранее препарата очищенного rec-proBNP (НЕК 293). Фурином обрабатывали исходные и дегликозилированные препараты белка. Для удаления углеводных остатков использовали два метода дегликозилирования: ферментативное и химическое с использованием ТФМС. Как уже упоминалось ранее, ферментативное дегликозилирование часто не позволяет добиться эффективного удаления О-гликанов по причине большого разнообразия углеводных структур, характерных для гликозилирования О-типа, и ограниченной субстратной специфичности доступных ферментов гликозидаз. Химическое дегликозилирование под действием ТФМС позволяет добиться практически полного удаления ковалентно связанных гликанов; его эффективность практически не зависит от состава углеводных структур. Однако большим недостатком этого метода является возможная денатурация белка, вызванная жесткими условиями проведения реакции.
Процессинг под действием рекомбинантного фурина исследовали с использованием следующих препаратов очищенного rec-proBNP, экспрессированного в клетках линии НЕК 293: интактного rec-proBNP, rec-proBNP после проведения ферментативного дегликозилирования, rec-proBNP после проведения химического дегликозилирования с использованием ТФМС. Также фурином обрабатывали исходно не гликозилированный rec-proBNP, экспрессированный в Е. coli. Степень расщепления rec-proBNP под действием фурина мы оценивали как долю молекул proBNP, подвергшихся расщеплению, выраженную в процентном отношении. Для этого мы определяли концентрацию rec-proBNP в пробе, обработанной фурином и концентрацию rec-proBNP в контрольной пробе (не обработанной фурином) с использованими системы 50Е1 io2-ios-16F3i3-20. Как уже было отмечено выше, данная- система позволяет определять содержание в пробе интактного (нерасщепленного) proBNP. Расщепление proBNP делает невозможным его детекцию с использованием- этой системы. Результаты оценки степени расщепления rec-proBNP под действием рекомбинантного фурина представлены на Рис. 36.
Как видно из Рис. 36А, интактный rec-proBNP (НЕК 293) устойчив к обработке рекомбинантным фурином, тогда как тот же белок после химического дегликозилирования, а также исходно не гликозилированный rec-proBNP (Е. coli), подвергались расщеплению на 89±1,0% и 95±0,6% соответственно. Дегликозилирование образца rec-proBNP (НЕК 293) с помощью ферментов приводило лишь к незначительному увеличению степени расщепления (23,5±4,3% от исходного количества). Эффективность дегликозилирования участка 67-76 rec-proBNP (НЕК 293) была оценена по увеличению иммунореактивности при измерении с использованием системы, состоящей из пары МАт, одно из которых было специфично к данному участку, а другое - к участку, не подверженному гликозилированию (28F867-76-13G12i3-2o). Оценка эффективности дегликозилирования участка 67-76 показала, что дегликозилирование с использованием ферментов гликозидаз было менее эффективно, чем химическое дегликозилирование с использованием ТФМС (Рис. 36Б). В результате, иммунореактивность rec-proBNP
