Введение к работе
Актуальность проблемы. Натрийуретический пептид В-типа (Brain Natriuretic Peptide, BNP) является пептидным гормоном, функциональным антагонистом ренин-ангиотензин-альдостероновой системы и симпатической нервной системы. BNP участвует в регуляции кровяного давления, объема жидкости в организме и её электролитного состава, вызывая вазодилатацию сосудов, ускоряя выведение натрия и усиливая диурез. BNP синтезируется кардиомиоцитами в виде прогормона proBNP (108 аминокислотных остатков, а.к.о.), который расщепляется специфической конвертазой с образованием физиологически активного BNP (32 а.к.о.) и N-концевого фрагмента прогормона (NT-proBNP, 76 а.к.о.), которые затем выделяются в кровоток.
Уровень экспрессии гена BNP и секреция BNP и NT-proBNP значительно увеличиваются в случае развития сердечной недостаточности (СН) - тяжелого заболевания, при котором сердце не способно обеспечить организм кровью в необходимых количествах. Клинические проявления СН неспецифичны, что затрудняет диагностику. Показано, что при СН концентрация BNP и NT-proBNP в крови увеличивается прямо пропорционально степени дисфункции левого желудочка сердца. В настоящее время измерение концентрации BNP и NT-proBNP иммунохимическими методами широко используется в клинической практике при обследовании больных с подозрением на СН. Использование BNP и NT-proBNP как биохимических маркеров СН позволяет значительно повысить точность диагностики заболевания. Помимо этого, измерение концентрации обоих пептидов в крови обладает высоким прогностическим значением у больных с СН, а также у больных, перенесших острый инфаркт миокарда. Несмотря на широкое применение в клинике, до последнего времени практически ничего не было известно о биохимических особенностях BNP и NT-proBNP, обнаруживаемых в крови человека. Однако, данные о том, в какой форме маркер существует в крови, необходимы для правильного выбора антител, используемых в иммунохимических диагностических системах. Известно, что на взаимодействие антител с белком-мишенью может оказывать влияние целый ряд факторов (протеолитическая деградация, комплексообразование, пострансляционные модификации и др.), что может приводить к недостоверным результатам при измерении концентрации маркера в крови пациента.
Основной целью данной диссертационной работы было изучение биохимических особенностей NT-proBNP, выделенного из крови больных с СН. Исследование NT-proBNP чрезвычайно осложнено низкой концентрацией белка в крови, варьирующей от 20-300 пг/мл у здоровых людей до 1-100 нг/мл у больных с СН. Поэтому в качестве высокочувствительного и высокоспецифичного инструмента в наших исследованиях, мы использовали моноклональные антитела (МАт), специфичные к различным эпитопам
молекулы NT-proBNP, полученные в ходе выполнения данной работы. В работе решались следующие задачи:
Получение набора моноклональных антител, специфичных к различным участкам молекулы NT-proBNP человека.
Получение молекулярно-генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного NT-proBNP человека в клетках Е. coli. Разработка метода получения и очистки рекомбинантного NT-proBNP, экспрессированного в клетках Е. coli.
Разработка метода получения очищенного препарата эндогенного NT-proBNP. Характеризация иммунохимических и биохимических свойств препарата эндогенного NT-proBNP.
Изучение факторов, оказывающих влияние на взаимодействие моноклональных антител с NT-proBNP, присутствующим в крови больных с СН.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые показано, что NT-proBNP человека является О-гликопротеином. Установлено, что остатки углеводов, входящие в состав молекулы эндогенного NT-proBNP, препятствуют взаимодействию антител с N-концевым участком (5-12 а.к.о.) и центральной частью белка (участок 28-60). Показано, что участки 13-24 и 63-76 молекулы NT-proBNP либо совсем не гликозилируются в организме человека, либо подвергаются гликозилированию лишь у незначительной части молекул NT-proBNP. В ходе работы были идентифицированы два сайта гликозилирования эндогенного NT-proBNP - остатки Sers и Thrss. Установлено, что уровень гликозилирования различных участков NT-proBNP сильно отличается среди больных с СН. Показано, что в крови NT-proBNP присутствует в виде набора отличающихся по массе гликоформ. Эксперименты по изучению стабильности эндогенного NT-proBNP показали, что эндогенный NT-proBNP устойчив к протеолитической деградации в сыворотке крови за исключением N-концевого участка молекулы. В крови больных с СН происходит отщепление двух аминокислотных остатков с N-конца молекулы NT-proBNP, что препятствует взаимодействию антител, специфичных к этому участку, с антигеном. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что гликозилирование и протеолитическая деградация негативно влияют на достоверность измерения концентрации NT-proBNP иммунохимическими методами, в которых используются антитела, специфичные к участкам 1-12 и 28-60. Такие системы серьезно недооценивают концентрацию NT-proBNP в пробе. Полученные данные могут найти практическое применение при разработке новых методов для количественного определения NT-proBNP. Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, на 34-м конгрессе Союза Европейских Биохимических
Сообществ в 2009 году (Прага, Чехия), съездах Американской Ассоциации Клинической Химии в 2009 (Чикаго, США), в 2008 (Вашингтон, США), в 2007 (Сан-Диего, США) и в 2005 (Орландо, США) годах; на XXXI Конгрессе Клинической Химии в 2008 году (Хельсинки, Финляндия); на четвертой Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения в 2008 году (Москва, Россия); на Международной конференции «Биотехнология и медицина» в 2006 году (Москва, Россия), а также на Международной научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2004 и 2006 годах (Москва, Россия).
Публикации. По теме диссертации было опубликовано 20 печатных работ, включая 4 статьи в профильном журнале.
Структура и объем работы. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты работы и их обсуждение, список цитированной литературы. Работа изложена на 141 странице печатного текста, иллюстрирована 43 рисунками и 8 таблицами. Список цитированной литературы содержит 161 наименование.
