Введение к работе
Актуальность проблемы. В процессах жизнедеятельности
клетки значительная роль принадлежит ферментативным реакциям,
протекающим под действием фермент-ферментных комплексов.
Изучению подобных комплексов в настоящее время уделяется особое
внимание. Функционирование ферментов в клетке связано о их
локализацией' на клеточных структурах. Образование компартментов,
в которых сосредоточены необходимые ферменты и пулы метаболитов,
приводит к протеканию ферментативных процессов с наибольшей
эффективностью.
Трансформация энергии в мышечной ткани обеспечивается
обратимой ассоциацией ферментов на миофибриллярных белках. К
такой группе ферментов . следует отнести креатинкиназу,
выполняющую структурную и ферментативную функции. Обе. функции
связаны о обеспечением мышечного сокращения энергией и ресинтеза
АТФ. Скорость креатинкиназной реакции зависит как от отношения
АТФ/АДФ, так и от отношения - креатинфосфат/неорганический
фосфат (КрФ/Ф„). Быстрое использование Ф„ может повысить
*» н
эффективность действия креатинкиназы. Утилизация Ф„ происходит в ключевой реакции гликогенолиза, катализируемой гликогенфосфорилазой.. Локализация' креатинкиназы и гликогенфосфорилазы на одних и тех же мышечных белках, в частности, на М- и I- линиях^ миофибрилл создает благоприятные условия их ассоциации. Можно предположить, что образование комплекса меаду етой парой ферментов способствует согласованному действию всех систем, контролирующих оптимальное функционирование мышц. Поэтому получение новой информации о
фермент-ферментных комплексах в мышечной клетке, об условиях их образования и распада, представляется актуальным направлением исследований в внзимологии.
Цель работы. Цель исследования состояла в том, чтобы выяснить возможность образования комплекса указанных ферментов с помощью физико-химических и кинетических методов, а также охарактеризовать его свойства. В соответствии о поставленной целью наше внимание было уделено решению следующих задач.
1. Изучить возможность образования комплекса
гликогенфосфорилазы Ъ с иммобилизованной на BrCN-оефарозе
хреатхшкиназоЯ.
2. Исследовать влияние различных физиологических факторов
(ионной силы, рН, субстратов и эффекторов гликогенфосфорилазы Ъ)
на ассоциацию ферментов.
3. Получить меченую флуоресцирующим соединением
гликогенфосфорилаэу Ъ и охарактеризовать ее взаимодействие со
свободной креатинкиназой.
4. Выяснить область локализации креатинкиназы на молекуле
гликогенфосфорилазы.
Научная новизна и практическая значимость работы. В последний период времени накоплено достаточно много информации о значении белок-белковых взаимодействий для функционирования клетки. Однако о способности к ассоциации таких функционально связанных ферментов, как креатинкиназа и гликогенфоофорилаза, ничего не было известно.
Активность гликогенфосфорилазы, катализирующей пусковую реакцию распада гликогена, лимитируется концентрацией неорганического фосфата, основным источником которого служит
креатинфоефат (КрФ). Синхронизация креэтинкинззной и фосфорилазной реакций, повышение их рффективноети, возможны, по-видимому, в случае ассоциации ферментов. В диссертационной работе при помощи ряда методов впервые получены сведения об образовании комплекса между гликогенфосфорилазой и креатинкиназой. Использование иммобилизации креатинкиназы на BrCN-активированной сефарозе 4В позволило установить, что гликогенфоефорилаза способна взаимодействовать как со свободной, так и с иммобилизованной формами креатинкиназы. Применение методов аффинной фронтальной хроматографии, распределительного равновесия, флуориметрического титрования, кинетического анализа позволило охарактеризовать комплекс, изучить условия его образования и влияние субстратов и вффекторов гликогенфосфорилазы b на ассоциацию ферментов. Анализ експериментальних данных позволяет полагать, что специфический участок связывания креатинкиназы расположен на аллостерическом домене субъединицы гликогенфосфорилазы Ъ.
Результаты диссертационной работы расширяют наш знания о
функционировании креатинкиназы и гликогенфосфорилазы в мышечной
клетке. ,
Материалы диссертации могут быть использованы в лекционных спецкурсах, читаемых на кафедре- биохимии Биологического факультета МГУ, а также в научной работе кафедры, института биохимии им.А.Н.Баха РАН и др.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на кафедре биохимии Биологического факультета МТУ.
Публикации. По теме диссертации опубликована работа, одна работа в печати.
Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа содержит 153 страницы машинописного текста, 10 таблиц, 25 рисунков. Список литературы включает 177 источников.'
