Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ
МОБИЛИЗАЦИЯ ЗАПАСНЫК БЕЛКОВ В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ, БОБОВЫХ (обзор)
Краткие сведения о запасных легуыино- и вици-линоподобных белках
Закономерности протеолиза запасных белков
Ферменты, осуществляющие мобилизацию запасных белков
Протеиназы, гидролизующие нативные запасные белки (протеиназы А)
Протеазы, гидролизующие запасные белки, модифицированные в процессе прорастания семян
Протеазы, участвующие в завершающих этапах распада запасных белков
2 .4. Действие протеолитических ферментов на запасные белки
Гидролиз запасных белков эндогенными протеиназами
Гидролиз запасных белков экзогенными протеиназами
Обобщение результатов исследования гидролиза запасных белков
Возможные механизмы мобилизации легумина в прорастающих семенах вики
О единстве основных закономерностей мобилизации запасных белков в семенах двудольных
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 39
Материалы 39
Определение активности протеолитических ферментов 40
Определение степени гидролиза белков 43
Последовательный и одновременный гидролиз
легумина-Т трипсином и карбоксипептидазой С 44
Определение белка 45
Выделение протеолитических ферментов 46
Электрофорез 48
Другие методы 49
ОЧИСТКА И ЧАСТИЧНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕИНАЗЫ В 51
Очистка протеиназы В 51
Частичная характеристика протеиназы В 62
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПР0ТЕ0ЛИЗА ЛЕГУМИНА вв
Гидролиз легумина трипсином 66
Гидролиз легумина протеиназой А 76
Последовательный гидролиз легумина протеиназами
А и В 83
Действие карбоксипептидазы С на продукты
частичного гидролиза легумина протеиназами 93
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 101
ВЫВОДЫ 104
ЛИТЕРАТУРА
Принятые сокращения
ДНС- Дансилхлорид
ЗБ Запасные белки
A3 Алейроновые зерна
ПААГ Полиакриламидный гель
ТНБС 2,4,6-тринитробензолсульфо-
кислота
ТХУ Трихлоруксусная кислота
sds Додецилсульфат натрия
ли Смещение равновесного положения
зоны белка при электрофорезе
на бумаге
Введение к работе
В последнее десятилетие достигнуты значительные успехи в изучении механизмов мобилизации запасных белков (ЗБ) в прорастающих семенах и ферментов, осуществляющих этот процесс. Это обусловлено повышенным интересом исследователей к ЗБ семян вообще - как резерву для восполнения белкового дефицита в питании и как удобному модельному объекту при изучении двух диаметрально противоположных процессов обмена внутриклеточных белков - биосинтеза и катаболизма.
В семенах бобовых идентифицированы основные протеазы, осуществляющие мобилизацию ЗБ, разработаны методы очистки некоторых из них, установлена последовательность их действия /35, 177/.
Однако, закономерности расщепления ЗБ каждым из этих ферментов остаются невыясненными.. Между тем, исследование характера гидролиза ЗБ эндогенными протеиназами in vitro очевидно, является необходимым дальнейшим этапом выяснения механизмов мобилизации ЗБ в прорастающих семенах. Такое исследование и явилось целью настоящей работы. Разработан метод очистки протеиназы В из прорастающих семян вики, изучены некоторые ее свойства. Получены высокоочищенные препараты протеиназ А и В и частично очищенный препарат нарбоксипептидазы С. Изучен гидролиз легумина вики под действием этих эндогенных ферментов и трипсина. Это позволило установить ряд закономерностей распада ЗБ в прорастающих семенах.
Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан метод получения хроматографически и электрофоретически
однородного препарата протеиназы В, получены данные о ее субстратной специфичности.
Установлены типы протеолиза запасного белка под действием трипсина и эндогенных протеиназ. Показаны два этапа гидролиза легумина трипсином: последовательный ("zipper») тип протеолиза на первом этапе сменяется "поодиночным" ("опе-Ъу-опе") на втором. Гидролиз легумина протеиназой А имеет смешанный характер. Протеиназа В "поодиночно" расщепляет легумин, модифицированный протеиназой А.
Показано, что природными субстратами карбоксипептидазы С являются преимущественно промежуточные продукты расщепления легумина протеиназами А и В.
Полученные в работе экспериментальные данные вносят вклад в установление закономерностей мобилизации ЗБ в прорастающих семенах бобовых и других двудольных. Сведения о типах протеолиза легуминоподобных белков под действием трипсина и эндогенных протеиназ позволят установить рациональный уровень воздействия протеиназ при ферментативной модификации функциональных свойств белковых изолятов из семян, используемых для приготовления новых форм высокобелковой пищи.
На защиту выносятся следующие положения:
Однородный по данным хроматографии и электрофореза препарат протеиназы В, не содержащий примеси других протео-литических ферментов, может быть получен по схеме, включающей хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, ковалентную хроматографию на Hg-сефарозе и гель-фильтрацию.
Расщепление легумина в прорастающих семенах вики, осуществляемое протеиназами А и В, происходит преимущественно по "поодиночному" механизму.
Различия в общем характере действия на легумин протеи-назы А, трипсина и, вероятно, ряда других экзогенных протеиназ определяется, главным образом, различиями в соотношении скоростей последовательного и "поодиночного" процессов.
Высокомолекулярный остаток легумина, обнаруживаемый в прорастающих семенах, представляет собой конечный продукт его превращений как белка. Продукты дальнейшего гидролиза, имеющего исключительно "поодиночный" характер, уже являются пептидами.
Основными природными субстратами карбоксипептидазы С являются промежуточные продукты расщепления ЗБ эндопептидаза-ми. Вклад карбоксипептидазы С в мобилизацию ЗБ на разных стадиях развития этого процесса определяется, главным образом, соотношением карбокси- и эндопептидазной активностей в прорастающих семенах.
Настоящая работа выполнялась в проблемной лаборатории химии белка Кишиневского государственного университета им. В.й.Ленина в связи с плановой темой "Исследование белков семян культурных растений, разработка основ повышения их качества и методов получения белковых изолятов для пищевых целей" (номер госрегистрации 8I0I2I94).
2. Мобилизация запасных белков в прорастающих семенах бобовых (обзор)
Современные представления о механизме мобилизации ЗБ, ферментах, осуществляющих этот процесс, и его регуляции сформировались, главным образом, на основе исследований, проведенных в течение последнего десятилетия. Успех этих исследований в значительной мере был обусловлен применением ЗБ в качестве субстратов при идентификации протеаз, осуществляющих их мобилизацию, и изучением превращений ЗБ при протеолизе in vivo И in vitro.
