Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10
ГЛАВА 1. ФОСФОЛИПИДЫ - ВАЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ БАКТЕРИАЛЬ
НЫХ МЕМБРАН 10
Структура и свойства фосфолипидов 10
Биосинтез фосфолипидов и его регуляция 16
Участие фосфолипидов в секреции белков 18
Взаимосвязь секреции с обменом фосфолипидов 18
Доказательства участия фосфолипидов в секреции белков, выявленные с помощью мутантных штаммов 20
Взаимодействие фосфолипидов с топогенными последовательностями секретируемого белка 24
Влияние фосфолипидов на функционирование компонентов секреторного аппарата 28
1.4 Участие фосфолипидов в репликации ДНК 32
Роль фосфолипидов в биогенезе клеточной оболочки 35
Участие фосфолипидов в фолдинге белков 38
Возможное участие фосфолипидов в регуляции экспрессии генов 41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 43
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 43
Бактериальные штаммы и плазмиды 44
Среды и условия культивирования 45
Выделение плазмидной ДНК 46
Полимеразная цепная реакция 47
Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК 48
Элиминация плазмиды pDD72 из клеток штамма AD93 48
Выделение суммарной РНК 49
Включение метки в 5'- конец олигонуклеотидного зонда 50
Нозерн-блот-гибридизация 50
Анализ динамики превращения импульсно меченого предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму 51
Анализ синтеза РНК 52
Иммуноферментный анализ щелочной фосфатазы 53
Иммуноферментный анализ липопротеина 53
Анализ фосфолипидного состава мембран 54
Экстракция липидов 54
Тонкослойная хроматография 55
Определение липидного фосфора 55
Электрофорез белков 55
Аналитические методы 56
Определение активности щелочной фосфатазы 56
Определение активности /?-галактозидазы 56
Определение содержания белка 57
Определение 2-кето-3-дезокси-0-маннооктоната 57
Определение содержания экзополисахаридов 57
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 58
ГЛАВА 3. УЧАСТИЕ ФОСФАтаДИЛГЛИЦЕРИНА В СЕКРЕЦИИ ЩЕЛОЧНОЙ
ФОСФАТАЗЫ ЧЕРЕЗ ЩЇГОГШАЗМАТИЧЕСКУЮ МЕМБРАНУ К COU 58
Инактивация rempgsA приводит к нарушению фосфолипидного состава мембран Е. coli 58
Инактивация генар#?Л снижает эффективность секреции щелочной
фосфатазы через цитоплазматическую мембрану Е. coli 60
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ АНИОННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ ІДЖОГІЛАЗМАТИЧЕС-
КОЙ МЕМБРАНЫ Е СОП НА СЕКРЕЦИЮ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В
КУЛЬТУРАЛЬНУЮ СРЕДУ И НА БИОГЕНЕЗ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ
ОБОЛОЧКИ 63
При инактивации гена pgsA увеличивается секреция щелочной фосфатазы через внешнюю мембрану 63
Изменение содержания анионных фосфолипидов мембран влияет на содержание и биогенез компонентов клеточной оболочки 65
ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН НА
ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА phoA 69
Биосинтез щелочной фосфатазы подавляется при инактивации гена pgsA 69
Инактивация гена pgsA влияет на динамику репрессии синтеза щелочной фосфатазы 71
Экспрессия генов под контролем Ррно промотора подавляется при изменении фосфолипидного состава мембран 72
Влияние фосфолипидного состава мембран на экспрессию reuaphoA
на уровне транскрипции 75
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 76
ВЫВОДЫ 80
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов секреции и экспрессии белков является важным фундаментальным исследованием, а также необходимым условием для создания научных основ технологии микробиологического производства ферментов. Транслокация белка из цитоплазмы в специфические компартменты клетки, или секреция, является основой многих процессов: биогенеза и сборки экзобелков и супрамолекулярных структур клеточной оболочки, регуляции метаболизма, а также взаимодействия клеток с окружающей средой. В настоящее время имеются значительные достижения в установлении основ этого процесса, однако, полностью понять его механизм невозможно без учета динамических особенностей структуры и метаболизма мембранных фосфолипидов, без рассмотрения экспрессии генов и секреции белков как части биогенеза клеточной оболочки, в котором фосфолипиды участвуют в качестве метаболических предшественников ее компонентов.
Состояние проблемы. К настоящему времени накоплено много экспериментальных данных, свидетельствующих об участии как анионных , фосфолипидов (Nesmeyanova, Bogdanov, 1989; De Vrije et al, 1990; Kusters et al, 1994; Nesmeyanova et al, 1997; Van Voorst, de Kruijff, 2000), так и цвиттерионного фосфатидилэтаноламина (Cullis, de Kruijff, 1978; Kietveld et al, 1995; Golovastov et al, 2000) в транслокации белков через цитоплазматическую мембрану бактерий. Эти результаты подтверждают гипотезу о важной роли фосфолипидов мембран в секреции белков, впервые высказанную М.А. Несмеяновой (Nesmeyanova, 1982). Показано, что для функционирования белковых компонентов секреторного аппарата требуются анионные фосфолипиды (АФЛ) (Lill et al, 1990; Hendrick, Wickner, 1991). Они также взаимодействуют с положительно заряженным N-концевым участком сигнального пептида предшественников белков при инициации секреции (Nesmeyanova, 1982; Kajava et al, 1991; Phoenix et al, 1993).
Цвиттерионный фосфолипид - фосфатидилэтаноламин участвует в секреторном процессе путем формирования небислойной структуры мембран, которая способствует транслокации белка через мембрану (Rietveld et al, 1995; Mikhaleva et al, 1999; Головастое и др., 2000). Недавно также показано, что этот фосфолипид взаимодействует с N-концевой областью зрелой полипептидной цепи, помогая, как предполагается, ее входу в транслокационный канал (Головастое и др., 2002). Кроме того, было установлено, что дисбаланс фосфолипидов, вызванный отсутствием фосфатидилэтаноламина, влияет не только на секрецию щелочной фосфатазы (PhoA), но и на экспрессию ее гена, контролируемого собственным промотором Ррно (Mikhaleva et al, 2001). Однако вклад индивидуальных классов фосфолипидов в экспрессию генов и секрецию белков, а также молекулярный механизм их вовлечения в эти процессы остаются мало изученными.
Ранее в лаборатории М.А. Несмеяновой были получены первые косвенные доказательства участия анионного фосфатидилглицерина (ФГ) в секреции щелочной фосфатазы Е. coli (Евдокимова, Несмеянова, 1977; Несмеянова, Евдокимова, 1979). Его содержание и обмен увеличивались в процессе секреции белка, и именно он был обнаружен в транслокационном сайте мембран (Богданов и др., 1985а,6). Позднее участие ФГ в секреции белков было подтверждено в опытах in vitro (De Vrije et al, 1988; Kusters et al., 1991). Однако прямые доказательства участия этого фосфолипида в секреции белка у бактерий in vivo отсутствуют. Остается неясным вносит ли именно фосфатидилглицерин вклад в секрецию или он может быть заменен другим анионным фосфолипидом?
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось установление роли индивидуальных классов фосфолипидов мембран в секреции щелочной фосфатазы и экспрессии ее гена у Е, coli, а также выявление взаимосвязи между секрецией белка и биогенезом клеточной оболочки.
В качестве модели для решения конкретных задач исследования
использовали щелочную фосфатазу Е. coli - типичный секретируемый белок,
биогенез которого хорошо изучен. Биогенез этого белка включает его синтез
в цитоплазме в виде предшественника, содержащего на N-конце
дополнительную последовательность, называемую сигнальным пептидом;
транслокацию предшественника через цитоплазматическую мембрану с
использованием Sec-зависимого секреторного пути; процессинг
(отщепление сигнального пептида сигнальной пептидазой на внешней стороне цитоплазматической мембраны) и посттранслокационную модификацию в периплазме с образованием активной формы фермента.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить влияние инактивации гена pgsA, ответственного за синтез фосфатидилглицерина у Е. coli, на секрецию PhoA in vivo и дифференцировать вклад в секрецию фосфатидилглицерина и других анионных фосфолипидов;
Исследовать влияние состава анионных фосфолипидов цитоплазматической мембраны на биогенез компонентов клеточной оболочки и вклад этих фосфолипидов во взаимосвязь секреции белка с биогенезом оболочки;
Изучить влияние изменений в фосфолипидном составе мембран, вызванных мутациями в генах фосфолипидного обмена pgsA npssA, ответственных за синтез ФГ и ФЭ, соответственно, на экспрессию гена щелочной фосфатазы.
Научная новизна работы. В настоящей работе с использованием мутантных штаммов Е. coli получены новые данные, свидетельствующие об участии in vivo анионного фосфолипида фосфатидилглицерина в экспрессии генов и секреции белков на примере щелочной фосфатазы. Результаты свидетельствуют о корреляции секреции PhoA с содержанием в клетках мутантных штаммов фосфатидилглицерина, а не анионных фосфолипидов в
целом, подтверждая участие в секреции PhoA именно этого фосфолипида. Кроме того, выявлено, что в условиях значительного снижения содержания фосфатидилглицерина подавляется не только секреция, но и биосинтез PhoA. Получены доказательства влияния фосфолипидного состава на экспрессию гена phoA, регулируемую PhoR-PhoB двухкомпонентной системой, с использованием созданной нами репортерной конструкции (pPHO/hcZ) и метода РНК-блот-гибридизации. Результаты данного исследования позволяют сделать заключение о том, что значительные изменения в составе мембранных фосфолипидов (преобладание фосфатидилэтаноламина в случае pgsA -мутантов и его полное отсутствие в pssA -мутантах), имеют одинаковый эффект на активность РРНо промотора и синтез мРНК гена щелочной фосфатазы.
Изучены особенности биогенеза оболочки у штаммов Е. coli с контролируемым синтезом анионных фосфолипидов. Результаты свидетельствуют в пользу того, что существует, во-первых, взаимосвязь между секрецией PhoA через цитоплазматическую мембрану и биогенезом компонентов оболочки (липопротеина и липополисахарида), во-вторых -между секрецией белка в среду и нарушением биогенеза компонентов оболочки, ответственных за ее проницаемость, в-третьих - фосфолипиды вносят определенный вклад в это взаимодействие.
Научно-практическое значение Решение поставленных в работе задач вносит новый вклад в понимание механизма участия наиболее динамичного компонента мембран - фосфолипидов в экспрессии генов и секреции белков у бактерий, что важно для многих областей клеточной биологии, биотехнологии и медицины, связанных с оптимизацией экспрессии важных секретируемых бактериальных ферментов.
