Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время потребности пищевой индустрии в сырье и пищевых добавках как технологического, так и функционального действия в значительной степени решаются за счет импортных поставок. Среди пищевых добавок определенную нишу занимают ингредиенты -продукты микробного синтеза. К их числу относятся широко используемые в пищевой промышленности лимонная кислота и ферменты амилолитического действия. Однако объемы производства в РФ этих ингредиентов, необходимых целому ряду отраслей (кондитерская, спиртовая, крахмалопаточная и др.), ниже существующих потребностей: по лимонной кислоте почти в три раза, по амилолитическим ферментам - в два раза.
К числу факторов, влияющих на развитие отечественной индустрии пищевых добавок, относятся ограниченность собственной сырьевой базы, недостаток инновационных технологий, позволяющих на базе имеющегося сырья решить проблему импортзамещения. Необходимо учитывать при этом возросшие в стране требования по экологическим нагрузкам на окружающую среду, что выдвигает новые требования к создаваемым технологиям и к действующим предприятиям. Поэтому разработка научных основ технологий микробного синтеза, базирующихся на отечественных источниках сырья, исключающих применение в технологическом процессе токсичных химических элементов, расширяющих номенклатуру и объемы отечественных пищевых ингредиентов, является актуальным направлением научных исследований.
Научные основы технологий лимонной кислоты с использованием углеводсодержащего сырья и продуцента Aspergillus niger разработаны B.C. Омелянксим, СП. Костычевым, СВ. Буткевич, Г.И. Журавским, О.Ф. Терентьевой, Е.С Минц, Е.Б. Львовой, Л.Н. Мушниковой, И.А. Аглиш, Т.А. Никифоровой и др. В течение 50 лет с момента организации в России профильного производства единственным промышленным сырьем является свекловичная меласса, состав которой требует постоянного контроля при его отборе, хранении, а также и в процессе химпереработки, сопровождающейся загрязняющими стоками, выбросами и утилизируемыми отходами. К числу перспективных сырьевых ресурсов, имеющих стабильную возобновляемую основу, относятся крахмалсодержащие зерновые культуры, широко возделываемые в РФ, свойства которых используется не в полной мере. В зарубежном производстве лимонной кислоты прослеживается тенденция к внедрению крахмалсодержащего сырья (Н. Василев, V.S. Shankaranand, Yu Yun-ling, W. Lesniak, K. Tsekova, G. Xie и др.). Поскольку оно может индуцировать биосинтез амилаз, то применение его в технологиях синтеза лимонной кислоты создает возможность максимальной реализации потенциала микромицетов рода Aspergillus в части получения еще одного целевого продукта, а именно, амилолитических ферментов. Крахмалсодержащее сырье может использоваться актиномицетами рода Streptomyces для продуцирования и ингибиторов амилаз с широкой специфичностью действия. Таким образом, крахмалсодержащее сырье перспективно для создания многопрофильного биотехнологического производства как индивидуальных, так и комплексных, функциональных пищевых добавок, дефицит которых существует на российском рынке.
В основу научного решения проблемы создания многоцелевого процесса положена концепция системного анализа нетрадиционных источников сырья с целью экологизации микробиологического производства за счет перехода на экологически чистое сырье - гидролизаты крахмалов, а также комплексного подхода к регуляции биосинтеза целевых продуктов и создания инновационных технологий ингредиентов, востребованных на российском рынке.
Цель работы - разработка научных основ и создание новых экологически безопасных технологий пищевых ингредиентов и добавок, содержащих продукты метаболизма микроорганизмов различных таксономических групп, при ферментации крахмалсодержащего сырья.
В задачи исследований входило проведение комплексных исследований, направленных на обоснование возможности получения с использованием гидролизатов крахмала в едином технологическом процессе нескольких целевых продуктов - лимонной кислоты и амилаз, а также ингибиторов гликозидаз, а именно:
разработка способов подготовки сырья - крахмала для получения лимонной кислоты, ферментов и ингибиторов;
выбор штаммов - продуцентов для получения лимонной кислоты, ферментов и ингибиторов гликозидаз, проведение скрининга;
- исследование механизмов биосинтеза и секреции а-амилазы и
глюкоамилазы - ключевых ферментов углеводного метаболизма при
биоконверсии гидролизатов крахмала в лимонную кислоту микромицетом
Aspergillus niger, их кинетических и обменных характеристик, стабильности в
клетке продуцента и во внеклеточном пространстве для установления путей
регуляции продуцирования;
- научное обоснование параметров формирования активного вегетативного
посевного мицелия продуцентов и технологических режимов культивирования
штаммов-кислотообразователей Aspergillus niger и штаммов актиномицетов рода
Streptomyces для повышения выхода и активности соответственно
амилолитических ферментов и ингибиторов амилаз;
исследование закономерностей биосинтеза ингибиторов амилаз стрептомицетами и установление химической природы целевых метаболитов;
- разработка способов выделения лимонной кислоты, амилаз и
ингибиторов амилаз;
- изучение физико-химических и биохимических свойств амилаз и
ингибиторов гликозидаз в составах препаратов и оценка их биологической
безопасности для разработки комплексных пищевых добавок и установления
эффективности их применения в технологиях хлебобулочных изделий и пива;
- разработка технологий и технической документации на производство в
одном технологическом процессе лимонной кислоты, комплексного
ферментного препарата кислотостабильных амилаз и комплексной пищевой
добавки на его основе, технологии ингибиторов амилаз и функциональной
комплексной пищевой добавки на его основе; рекомендации по применению
новых пищевых ингредиентов и добавок в пищевой промышленности.
Научная новизна заключается в следующем: - установлены закономерности биосинтеза лимонной кислоты при ферментации гидролизатов
крахмалов, на основании которых впервые разработаны приемы изменения направленности биотехнологического процесса с целью получения наряду с основным метаболитом ферментов амилолитического действия в качестве целевых продуктов микробиологического синтеза; обоснован механизм биосинтеза и секреции а-амилазы и глюкоамилазы, их роль в биоконверсии углеводов среды в процессе кислотообразования и установлены пути регуляции метаболизма микромицета Aspergillus niger для повышения эффективности продуцирования лимонной кислоты и амилаз;
- дана оценка стабильности, кинетических и обменных характеристик
амилаз для корректного определения их активности в клетках продуцента и
культуральной среде и исследованы биокаталитические, физико-химические
свойства, компонентный состав, микрофлора ферментных препаратов и
выявлены направления их применения;
разработаны эффективные, экологически безопасные способы выделения целевых продуктов микробного синтеза, позволяющие получать пищевую кристаллическую лимонную кислоту в соответствии с ГОСТ 908-2004 и комплексный препарат кислотостабильных ферментов Глюкоамилонигрин с активностями амилаз на уровне мультиэнзимных композиций, декларируемых зарубежными фирмами, и высокоочищенные препараты амилаз;
установлено наличие в культуральной жидкости, полученной в процессе ферментации гидролизатов крахмалов в лимонную кислоту, ингибиторов амилаз и выявлено их структурное подобие известным ингибиторам гликозидаз псевдосахаридной природы, синтезируемым актиномицетами рода Streptomyces.
путем ступенчатого отбора из культур актиномицетов коллекции ГНУ ВНИИПАКК Россельхозакадемии выделены и запатентованы штаммы Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus Ac-1734 -продуценты ингибиторов амилаз;
- исследовано влияние углеводов различной структуры, степени
деструкции крахмалсодержащего сырья на биосинтез ингибитора амилаз и
обоснована целесообразность использования в качестве источника сырья
гидролизатов кукурузного крахмала;
- выявлены закономерности биосинтеза ингибиторов амилаз, разработаны
составы питательных сред и определены условия культивирования продуцентов
для продуктивного биосинтеза целевых метаболитов;
установлена природа выделенных ингибиторов и разработан способ получения препаратов с активностью на уровне и выше известных аналогов;
установлено гипогликемическое действие полученных ингибиторов гликозидаз в опытах in vivo на лабораторных животных;
научно обоснованы и разработаны составы комплексных пищевых добавок и изучено их действие в различных пищевых системах; выявлено, что Глюкоамилонигрин, содержащий кислотостабильные гидролазы, способствует интенсификации гидролиза растительных полимеров, а Люцентин и Виолацентин, состав которых включает ингибиторы гликозидаз, снижают уровень легкоусвояемых Сахаров в хлебобулочных изделиях без изменения технологических и органолептических показателей.
Новизна предлагаемых технических решений защищена 12 патентами.
Основные положения, выносимые на защиту:
Закономерности биодеструкции гидролизатов крахмала микроорганизмами различных таксономических групп для разработки «совмещенной» технологии лимонной кислоты и амилаз и технологии ингибиторов гликозидаз.
Критерии оценки направленности биосинтеза и пути его регуляции при
биоконверсии продуктов деструкции крахмала продуцентом лимонной кислоты -
микромицетом Aspergillus niger, сформулированные на основе характеристик
кинетики и метаболизма синтезируемых им ключевых амилолитических
ферментов (а-амилаза и глюкоамилаза) углеводного обмена.
Особенности биосинтеза ингибиторов гликозидаз при ферментации
гидролизатов крахмалов штаммами аспергиллов и актиномицетов; свойства
ингибиторов.
Обоснование компонентного состава рецептур комплексных пищевых добавок, содержащих кислотостабильные гидролазы и ингибиторы гликозидаз, полифункционального назначения и функционального действия.
Методология получения пищевых ингредиентов и добавок на основе
продуктов биоконверсии деструктурированного крахмалсодержащего сырья для
расширения ассортимента и повышения рентабельности монопроизводства.
Практическая значимость. На основании материалов исследований разработаны:
принципиально новые конкурентоспособные на мировом рынке
технологии лимонной кислоты и амилаз и комплексной пищевой добавки
Глюкоамилонигрин (ТИ 085-00334557-2004, ТИ 091-0034557-2005, ТИ 092-
0034557-2005);
инновационные технологии ингибиторов гликозидаз и комплексных пищевых добавок функционального назначения на их основе (ТИ 115-00334557-2008);
модифицированный метод определения глюкоамилазной активности в культуральной жидкости, ферментных препаратах и пищевых добавках; утверждены:
техническая документация на ферментный препарат Глюкоамилонигрин
в жидкой и порошкообразной формах (ТУ 9199-002-00334557-04). Получено
Санитарно-эпидемиологическое заключение ФГУЗ «Информационно-
методический центр «Экспертиза» Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека о возможности
использования Глюкоамилонигрина в пищевой промышленности
(№ 77.99.24.919.Т.001.091.06.05. от 20.06.2005);
два вида новой продукции - добавки пищевые функционального
назначения для продуктов профилактического направления Люцентин (РЦ 234-
002-00334557-08) и Виолацентин (РЦ 235-002-00334557-08) и соответствующая
разработанная техническая документация (ТУ 9199-080-00334557-08,
ТУ 9199-081-00334557-08);
методические указания по применению препарата Глюкоамилонигрин в
пищевой промышленности (РД 059-00334557-2004) и методические
рекомендации по применению ингибитора гликозидаз в пищевых продуктах
(РД 092-00334557-2008); проведены с положительным результатом опытно-промышленные испытания улучшителя на основе ферментного препарата Глюкоамилонигрин в хлебопекарном производстве и приготовлении пива; препарат ингибитора гликозидаз и комплексные пищевые добавки на его основе испытаны при приготовлении хлеба различных сортов;
методические указания для оценки содержания конидий продуцента в воздухе рабочей зоны при получении лимонной кислоты в лабораторных или производственных условиях с использованием различных видов сырья, в том числе и крахмалсодержащего: МУК 4.2.2656-10. «Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны» (2010);
требования к качеству гидролизатов крахмалов как к сырью для промышленного производства лимонной кислоты (ГОСТ Р 52672-2006. «Гидролизаты крахмала. Общие технические условия»).
Методология подготовки крахмалов к ферментации использована для разработки новых технологий лимонной кислоты на базе зернового крахмалсодержащего сырья.
Материалы исследований в виде отдельных разделов вошли в монографию «Биосинтез и выделение лимонной кислоты и амилолитических ферментов» (Кулев Д.Х., Шарова Н.Ю., - М.: ДеЛи принт, 2008. - 128 с), рекомендованную к использованию в учебном процессе высших учебных заведений.
Разработки технологий лимонной кислоты и амилолитических ферментов, ингибиторов гликозидаз и пищевых добавок на их основе награждены дипломами международной выставки-ярмарки «АгроРусь» (2007, 2009), седьмого международного профессионального конкурса «Ингредиент года 2008». Цикл исследований по созданию пищевых композиций антидиабетического направления на основе ингибиторов гликозидаз микробного происхождения в Конкурсе на лучшие инновационные проекты в сфере науки и высшего профессионального образования СПб в 2011 г. признан победителем в номинации «Лучшая научно-инновационная идея» (диплом ИП № 10/11).
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях (НПК) Отделения хранения и переработки сельскохозяйственной продукции Россельхозакадемии (Углич, 2000-2004, 2006, 2007, 2010,2012), Всероссийской НПК «Перспективные технологии пищевых добавок» (СПб, 2007); четвертом Международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2000» (СПб, 2000), Международном форуме «Биотехнология и современность» (СПб, 2003, 2006); Международных научно-практических симпозиумах (НПС) по направлению «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва, 2004,2006,2008,2010,2012), третьей Международной НПК «Низкотемпературные и пищевые технологии в XXI веке» (СПб, 2007), седьмой Международной конференции «Масложировая индустрия - 2007» (СПб, 2007), Международном форуме «Пищевые ингредиенты - 2008» (Москва, 2008), НПК «Пищевые добавки и современные технологии переработки сельскохозяйственного сырья» (СПб, 2011), Международной НПК «Крахмал и
крахмалопродукты, состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), Европейском конгрессе «The first North and East European Congress on Food. NEEFood-2012» (СПб, 2012).
Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы изложены в 92 научных работах, в том числе 12 патентах, 2 монографиях. Основные материалы диссертации представлены 35 статьями в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 241 страницах машинописного текста, содержит 73 таблицы и 62 рисунка, состоит из введения, аналитического обзора, объектов, методов и результатов экспериментальных исследований, изложенных в 3 основных главах, заключения, выводов, списка использованных источников и основных обозначений, содержит 53 приложения. Библиографический список состоит из 400 наименований (206 иностранных).
