Содержание к диссертации
Введение
Вводная глава. - 6
1.1. Актуальность работы. - 6
1.2. История проблемы криохранения генофонда. - 8
1.3. Особенности криосохранения культивируемых клеток растений - II
1.4. Цели и задачи исследования - 14
1.5. Научная новизна работы - 15
1.6. Практическое значение исследования - 17
1.7. Апробация работы - 18
ГЛАВА 2. Обзор литературы: основные механизмы криоповрещенмя клеток растений - 21
2.1. Образование льда - 21
2.2. Влияние solution effects - 28
2.3. Обезвоживание клеток и плазмалемла - 32.
ГЛАВА 3. Обзор литературы: криосохранение клеточных штаммов растении
3.1. Поиски подходов к решению проблемы - 56
3.2. Процедура криосохранения
3.2.1. Специальное предварительное культивирование (pregrowth)- 60
3.2.2. Сбор и концентрирование клеточной культуры - 65
3.2.3. Криозащита , - 66
3.2.4. Глубокое заморзживание -
3.2.4.1. Программное замораживание - 72
3.2.4.2. Упрощенные способы замораживания - 74
3.2.4.3. Витрификация -
3.2.5. Хранение - 78
3.2.6. Оттаивание - 80
3.2.7. Возобновление роста клеток - рекультивирование - 81
3.2.8. Характеристики восстановленных клеточных культур
ГЛАВА 4. Эксперименталбная часть: объекты м методы исследования - 89
4.1. Объекты - 89
4.2. Методы - 95
ГЛАВА 5. Экспериментальная часть: результаты мсследвания -І03
5.1. Исследование физиологического состояния клеточных культур-103
5.1.1. Физиологические особенности культуры клеток моркови -108
5.1.2. Суспензионные культуры клеток даоскореи дельтовидной -112
5.1.3. Каллуоные клеточные культуры диоскорей кавказской и балканской -119
5.1.4. Суспензионные культуры клеток зкеньшеней Panose ginseng, P. qulnquefalius (американского), P. Japonicua -124
5.2. Влияние криопротекторов на выживаемость -125
5.2.1. Дополнительная криозащита клеток моркови -133
5.3. Действие специального предварительного культивирования (подготовка к криосохранению) -138
5.3.1. Закаливание суспензионшых клеточных культур -138
5.3.2. Снижение водного потенциала питательной среды -150
5.3.3. Эффект прелина и других антистрессовых аминокислот -153
5.3.4. Влияние краткой инкубации при пониженной температуре -160
5.4. Исследования крио- и осмоустойчивости плазмалеммы клеток растеши In vitro -165
5.4.1. Флуориметрический метод определения деструкции плазмалеммы -166
5.4.2. Повреждения плазмалеммы клеток диоскорей при замораживании-оттаивании и эквиосмотическом сжатии -171
5.4.3. Повреждения плазмалеммы клеток женьшеня при замораживании-оттаивании и эквиосмотическом сжатии -184
5.4.4. Влияние глубокого замораживания на К+-стимулируемую М82+aзави имую Н+-АТФазу плазмалеммы клеток женьшеня штамма Ж-2 -189
5.4.4.1. Модификация метода выделения везикул плазмалеммы для культивируемых клеток женьшеня штамма Ж-2 -191
5.4.4.2. Активность К -, Mg -, Н+-АТФазы плазмалеммы контрольной и закаленной культур клеток женьшеня штамма Ж-2 до и после глубокого замораживания -194
5.5. Значение скорости замораживания и процессов льдообразования в растворе криопротекторов для выживаемости клеток -201
5.5.1. Изучение процессов кристаллизации криозашитных растворов -206
5.5.2. Обеспечение плавного обезвоживания клеток при инициации кристаллизации -216
5.6. Исследование восстановления клеточных и тканевых культур после оттаивания из жидкого азота -233
5.6.1. Оттаивание -233
5.6.2. Изучение концентрационных градиентов при удалении криопротекторов и рекультивировании клеток -233
5.6.3. Физиологические, цитологические и биохимические характеристики клеточных культур, восстановленных после длительного хранения в жидком азоте -240
5.7. Регенерация растений после криохранения их клеточных культур -256
ГЛАВА 6. Анализ полу шнных данных и разработка концепции криоустойчивости (обсуждение результатов) -266
Заключение -289
Выводы
Литература
- Особенности криосохранения культивируемых клеток растений
- Влияние solution effects
- Упрощенные способы замораживания
- Каллуоные клеточные культуры диоскорей кавказской и балканской
Введение к работе
Актуальность проблемы. В условиях глобального экологического неблагополучия проблема сохранения генофонда растений приобрела особое значение. В России нуждаются в охране около 4000 видов, из которых 533 уже внесено в Красную Книгу, а 76 находятся под непосредственной угрозой исчезновения [Красная Книга, 1988]. Традиционных средств сохранения биологического разнообразия растений (заповедники, ботанические сады, коллекции семян и вегетативно размножаемых форм) из-за присущих им ограничений давно уже недостаточно.
Методы культивирования in vitro клеток, тканей, меристем, зи-готических и соматических зародышей растений позволили создать биотехнологию поддержания и хранения генофонда при замедленном росте этих объектов (депонирование). Клеточные штаммы растений сохраняют значительную часть генома и, обеспечивая биосинтез вторичных метаболитов, имеют уже не только чисто научное, но и производственное значение. Однако, коллекции in vitro требуют значительных непроизводительных затрат ручного труда, энергии, реактивов. Поддерживание клеточных штаммов в таких коллекциях является вынужденным, так как клетки, растущие in vitro, (за редкими исключениями) нестабильны и могут утратить свои свойства [Шамина, 1978]. Коллекции клеток животных давно уже хранятся в жидком азоте (-196С).
Проблема длительного хранения генофонда растений и их клеточных штаммов стала, в сущности, проблемой криосохранения семян, апексов побегов, эмбрионов и клеток in vitro [Туманов, Бутенко и др. 1968; Street, 19Т5; Бутенко, Попов, 1979; Fay, 1994]. Апексы in vitro, в отличие от клеток, регенерируют исходный генотип и обеспечивают сохранение не только сортов, форм и видов вегетативно размножающихся и других растений, но и клонирование отдельных экземпляров. Для криоколлекций растений прежде всего надо использовать семена и меристемы побегов. По криохранешш семян проведены отечественные работы В.Ю.Молодкиным [1987], В.Л.Тихоновой [1985, 1992], Т.Ф.Стрибуль [1993]. Ряд авторов в некоторых совместных экспериментах, проведенных в Институте физиологии растений им.К.А. Тимирязева РАН, достигли криосохранения апексов картофеля Шанжулин и др., 1982, 1983; Донец и др., 1991; Попов и др., 1991], наперстянки, ромашки [Diettrich et al., 1987, 1990], земляники садовой [ Высоцкая и др., 1996 ].
однако, настоящее исследование ограничено проблемой криосохра-
нения клеточных штаммов. Решение этой проблемы не только позволило бы гарантировать неизменность хранимых образцов и резко сократить
затраты на коллекцию, но и обеспечить ее миниатюризацию, так как в криобанке (например, в нашем) 15 000 ампул объемом по 1,5-2,0 их каждая (5-50 ампул на образец) размещаются на площади около I кв.м и возможности дальнейшего уплотнения хранения далеко еще не исчерпаны. Таким образом, проблема криорезистентности клеток и тканей растений In vitro, их естественная и искусственная защита от криоповреждений выходит на первый план.
Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение фи-зиологии криоустойчивости клеточных штаммоЕ растений, культивируемых In vitro, разработка научных основ биотехнологии криосохранени и организация криобанка клеток, тканей и микроорганов растений.
Необходимо было решить следующие задачи:
-
Исследовать закономерности формирования криоустойчивости и повысить ее до необходимого уровня, изучая физиологические характеристики штаммов и оптимизируя режимы их культивирования.
-
Исследовать влияние на криоустойчивость скорости охлаждения и зависимость от нее процессов льдообразования в криозащитных растворах и в клетках. Разработать универсальный для клеток растения режим замораживания.
-
Изучить крио- и осмонарушения клеточной мембраны, как главной мишени повреждений при замораживании, и разработать для этого относительно простой метод выявления летальных для клеток деструкции плазмалеммы.
-
Исследовать некоторые решающие процессы на этапе восстановления роста штаммов на основе изучения концентраций токсичных ве-шестЕ и снижения осмотических градиентов. Усовершенствовать удаление криопротекторов и рекультивирование клеток.
-
На осноеє выявленных закономерностей разработать концепцию криорезистентности клеток растений, культивируемых in vitro.
в. Охарактеризовать восстановленные после криоконсервации клеточные культуры по цитологическим, цитогенетическим, физиологическим признакам. Проверить сохранность этих признаков, а также биосинтетического потенциала у рекультивированных штаммов. Регенерировать растения из клеток штаммов, возобновивших рост после оттаивания из жидкого азота, в тех случаях, в которых исходные культурі
обладали способностью к регенерации.
Научная новизна работы. Впервые в России изучена криоустойчи-вость до -1960 2У клеточных штаммов In vitro, полученных из 18 видов растеши. Разработаны научные основы криохранения.
Для успешного возобновления роста и развития оЕодненных клеток и тканей после глубокого замораживания-оттаивания обязательно не-ходшо использовать криозащитные вещества. В качестве криопротек-торов полезно иногда применять необычные для клеток растений среды. Обнаружено впервые, что сыворотка крови эмбрионов телят оказывает мощную дополнительную криозашиту при замораживании (2С/мин) клеток моркови без инициации кристаллизации.
Впервые доказана необходимость инициации кристаллизации крио-защитного раствора при медленном (<1С/мин) охлаждении клеток растений 1л vitro с целью их криосохранения. Тем самым наша программа замораживания обеспечивает отсутствие губительного внутриклеточного льда (по крайней мере до -27С).
Установлено, что для многих клеточных штаммов растений нужна подготовка (специальное предварительное культивирование) к криосо-хранению и найдены новые способы такой подготовки: I. Холодовое закаливание суспензионных культур клеток Panax ginseng, которое обеспечило наилучшие результаты при условии постепенного добавления в среду сахарозы. 2. Предкультивирование с некоторыми аминокислотами крионеустойчивого штамма Dioscorea deltoidea. 3. Инкубация этих же и некоторых других клеток 18-20 ч при 9-10.
Доказано, что после многолетнего криохранения штаммы восстанавливают все свои основные характеристики, в том числе и биосинтез вторичных соединений, а также регенерируют растения, если они обладали такой способностью до замораживания.
Обнаружено, что криоустойчиЕость клеток In vitro лишь отчасти коррелирует с повышенным содержанием эндогенных Сахаров и сниженной оводненностью. В то же время у изученных штаммов Dioscorea deltoidea- криорезистентность коррелировала с преобладанием да- и триплоидных клеток.
Разработан новый флуориметрический метод,- однозначно выявляющий деструктивные повреждения плазмалеммы, летальные для клеток. Обнаружено почти полное совпадение между крио- и осмоустсйчивостью при 2 - 4 С у 5 клеточных штаммов столь отдаленных видов, как Panax ginseng и dioscorea deltoidea.
Выдвинута и экспериментально обоснована концепция формирования криоустойчивости клеток растений, которая использует принципы как предотвращения образования внутриклеточного льда, так и повышения устойчивости плазмалеммы при глубокой дегидратации и регидратации клеток. Предположено, что необратимый этап повреждения (деструкцш этой мембраны (образование мицелл Я^-фазы в липидах ее бислоя) не ступает тогда, когда начинается удаление воды из самого бислоя.
Практическое значение работы. Создан первый в России и сопре-дельных странах криооанк клеточных штаммов растений, постоянно хранящий 18 линий 12 еидов (13 линий продуценты); клетки исчезающих эндемичных еидов Dioscorea саисазіса LIpsky и D.balcanica Ко-Sanln регенерировали растения. Разработаны устройства к замораки-вателям для автоматической инициации кристаллизации раствора в ампулах, одно из которых согласно акту об использовании изобретения установлено уже на нескольких моделях таких аппаратов.
Апробация работы и публикации. Результаты работы докладывались на: I, 2, 3 и 4 Всесоюзных и Международных конференциях "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 1977, 1984, 1988, 1992); 3, 4, 5 и 6-й (Абовян, 1979, Кишинев, 1983, Новосибирск, 1988, Алмати, Казахстан, 1993) Международных конференциях "Биология культивируемых клеток и биотехнология"; 4 и 5 Съездах ВОГИС им. Н.И.Вавилова (Кишинев, 1982, Москва, 1987); International Symposium "Plant Tissue and. Cell Culture: Application to Crop Improvement" (Olomouc, Czechoslovakia, 1984); Symposium "Biogene Arsnelstoiie, Auffln-dung, Chemie, Blotechnologle" (Berlin, 1986); VII International Congress for Culture Collections: "Biodiversity and the Role of Culture Collections" (Beijing, China, 1992); XI Slmpozljum Jugo-slovenskog Drustva за Flsiologi^u Biljaka (Nov! Sad, Jugoslavia, 1995), а также на совещаниях Группы Консервации Генома Международного Союза Охраны Природы в Пущино н/Оке и на других конференциях.
По материалам данного исследования вышло 73 публикации, в том числе 39 статей и глав в книгах в отечественных и зарубежных изданиях, получено 6 авторских свидетельств и патентов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Физиологические процессы, определяющие криорезистентность клеток in vitro, многообразны и различны на разных этапах сложной, экстремальной процедуры криосо-
Особенности криосохранения культивируемых клеток растений
Работа носит пионерный характер: впервые в России и СН1 , да и в Восточной Европе изучена криоустойчивость до -1960 29 клеточных штаммов in уitro, полученных из 18 видов растений, из которых в настоящее время постоянно хранятся в жидком азоте и возоОновляют рост после оттаивания 18 штаммов из 12 видов, в том числе впервые достигнуто криосохранение клеток 7 видов. Разработаны научные основы криохранения=
Для успешного возобновления роста и развития оводнекных клеток и тканей после глубокого замораживания-оттаивания обязательно не 16 ходймо использовать криозащитные вещества, В качестве криопротк--торов полезно иногда применять необычные для клеток растений среды. Обнаружено впервые, что сыворотка крови эмбрионов телят оказывает. мощную дополнительную криозащиту при замораживании (20/мин) клеток моркови без инициации кристаллизации.
Впервые доказана необходимость инициации кристаллизации крио-защитного раствора при медленном ( 10Смин) охлаждении клеток растений In Yitro с целью их криосохранения. Разработанная нами программа замораживания обеспечивает отсутствие губительного внутриклеточного льда (по крайней мере до -27С).
Выдвинуто представление и экспериментально установлено, что для многих клеточных штаммов растений нужна подготовка (специальное предварительное культивирование) к криосохранению и найдены новые способы такой подготовки: I. Холодовое закаливание в течение 3 нед суспензионных культур клеток Рстсш ginseng? которое обеспечило наилучшие результаты при условии постепенного добавления в среду сахарозы, 2, Предкультивирование с некоторыми аминокислотами (пролин, аспарагин, аланин, серии) крионеустойчивого штамма Dios-согесі delioiclect, 3, Инкубация этих же и некоторых других клеток 18 -20 ч при 9-10. Причем показана аддитивность выживвемости клеток при сочетании двух последних способов.
Доказано, что после многолетнего криохранения штаммы восстанавливают все свои основные характеристики, в том числе и биосинтез вторичных соединений, а также регенерируют растения, если они обладали такой способностью до замораживания, В частности, впервые регенерированы растения двух эндемичных, редких, исчезающих видов: Bloscorea cauoasica и B„balccmica„
Обнаружено, что криоустойчивость клеток In Yitro лишь отчасти коррелирует с повышенным содержанием эндогенных сахароз и сниженой оводненностью. В то же время у изученных штаммов Віозсогеа deltoidea криорезистентность коррешировала с преобладанием ди- и триплоидных клеток.
Разработан новый флуориметрический метод, однозначно выявляю--ищи деструктивные повреждения плазмалеммы, летальные для клеток. Обнаружено почти полное совпадение между крио- и осмоустойчивостью (При 2-4 1J0) у 5 клеточных штаммов столь отдаленных видов, как Panax ginseng й Віозсогеа deltoidea.
Выдвинута и экспериментально обоснована концепция формирования криоустойчивости клеток растений, которая использует принципы как предотвращения образования внутриклеточного льда, так и повышения устойчивости плазмалеммы при глубокой дегидратации и регидратации клеток. Предположено, что необратимый этап повреждения этой мембраны (деструкции, образование мицелл Ятт-фазы в липидах ее бислоя) наступает тогда, когда начинается удаление воды из самого бислоя. 1,6. Практическое значение исследования.
Проведенное изучение криоустойчивости клеток растений m vitro позволило создать первый в России, СНГ и сопредельных государствах криоОанк клеточных штаммов растений. В настоящее время в нем хранятся постоянно 18 линий (полученных из 12 видов), из которых 13 -продуценты или потенциальные продуценты лекарственных или других экономически ценных веществ, остальные представляют научный интерес для теоретических исследований. Особое значение имеют хранящиеся каллусные штаммы очень редких, исчезающих видов Віозсогеа осшг-сазіса Мраку и B.balcanica KoSanln, т.к. эти штаммы являются эмО-рио- и морфогенными и уже получено их восстановление и "регенерация ими растений in Yltro и in Yivo (В оранжерее) после оттаивания из жидкого азота. Следовательно, можно надеяться, что данные виды Оудут спасены чтобы ни СЛуЧИлось с НИМИ в природных местах щюизтэа - 18 станин. Некоторые из хранящихся клеточных линий уже служат основой ииотехнологйческих производств на заводах и поэтому представлены в криобанке достаточно большим количеством ампул (до 50). Таким образом, разработаны научные основы для криохранения клеточных штаммов растений in vitro.
Полученные знания, опыт и методические подходы применялись и прФменяются тавже и в работах по криосохранению меристематических верхушек побегов некоторых сельскохозяйственных растений, размножаемых вегетативно. В частности, в настоящее время в криобанге на длительном хранении находятся апексы 4-х сортов земляники садовой и одного - малины (работа 0.Н,Высоцкой).
В процессе исследований режима замораживания разработаны 3 устройства к программным замораживателям для автоматической инициации кристаллизации раствора в криоампулах. Одно из этих устройств с 1988 г. установлено по крайней мере на 8 моделях данных аппаратов. Тем самым отечественное приборостроительное Специальное кон-структорско-технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины не только вышло на уровень ведущис фирМ мира, выпускающих аналогичную продукцию (например "СгуоМесГ, USA; "PLANER BIOMED", England), но и превзошло их в некоторых отношениях.
Влияние solution effects
Причины необратимого повреждения плазмалеммы остаются дискуссионными. Многочисленные прежние исследования тотального мембранного материала клеток или их органелл и липидов не могут теперь привлекаться к решению этого вопроса, т.к. 80% такого материала составляют эндомембраны, характеристики которых существенно отличаются [ Yosiiida S,, 1984 а; Lynch П., Steponkns P,, 1987 ]. Метод ЭПР с применением спиновых меток и флуоресцентные зонды требуют предварительного доказательства, что данная метка (зонд) в основном сосредоточена именно в плазмалемме. Специально испытанные многочисленные метки оказались равномерно распределенными в клетке и лишь Фосфатидилхолиновая спиновая метка селективно сохранялась в плазмалемме [ Briggs S=, Hang A= et al,, 1982 ]= Тем не менее следует отметить некоторые работы, показавшие корреляцию между внезапным сдвигом температурной зависимости сверхтонкого расщепления ЭПР-сигнала жирно-кислотвой метки (свидетельство увеличения молекулярной упорядочности в мембранах) и летальной температуры при замораживании с очень малой ( 0,1"С/мин ) скоростью изолированных клеток и протопластов из закаленных и незакаленных проростков РЖИ сорта Puma, Такая скорость полностью исключает образование льда внутри клеток. Причем речь идет о метке, локализованной вблизи (около 2 нм) гидратированных головок фосфолипидов. Поэтому авторы ОІТПавеДЖВО заКЛюЧИЛИ, что увеличение уПОряДОЧНОСТИ фосфоЛШШДНЫх молекул ПРОИЗоШЛО в зоне их головок в результате нарастающей дегидратации ггои снижении температуры и возрастании количества внеклеточного льда [ Slniii. J,, Miller R, , 1980, 1982 3, Увеличение упоря ОчНОСТИ СКорее всего яВИлось реЗУЛЬТаТОМ сбЛИЖВЧИЯ MO.TiP.KуJi в б ип.пое мембгп.ан ПРИ удалнНИи из него воды, В СУЩНОсТИ э ТИ данные дополняют результаты Степонкуса и соавторов, тем более что они получены на тг;м зке объекте
Изолировать плазмалемму из клеток растений достаточно трудно. Но в ряде лабораторий проведены успешные эксперименты. Сравнивали характержстики плазмалеммы после выделения из незакаленных и закаленных растений ржи (сорт Puma), ежи сборной и шелковицы. Оказалось, что по мере закаливания на 20-35% возрастает количество фос-фолипидов по отношению к белкам плазмалеммы, снижается температура термозависимого фазового перехода этой мембраны из жидкокристаллического состояния в гель (у шелковицы и ежи,5 а состав фосфолипи-доБ и их ненасыщенность (зa исключением шелковицы, у котоРОй она увеличивалась при максимальной закалке на 46%) не изменяются [ Yo-shlcla S,, 1982: Yoshicla S,, 1984 a,b! Uemura M,, Yosliicla S,, 1984: Yoshiola S,, иemurа M., 1984; Myers P., ,Heser rP .e tal, 1985 5,1 Заманчиво на первый взгляд отмеченное Иошидой в работах 1982-84 гг, почти точное совпадение точки термотропного фазового перехода в плазмалемме и летальной температуры для растений. Иными словами, разная морозостойкость могла бы быть объяснена различной температурой перехода липидов плазмалеммы из жидкокристаллического состояния в гель, поскольку существует гипотеза, обоснованная многими данными на модельных мембранах, о термотропных фазовых переходах как причине повреждения клеточных мембран. Но значение указанного выше совпадения не следует преувеличивать, т.к. необратимые повре-ждения плазмалеммы происходят также и в гипертонических растворах без снижения температуры и тем более без замораживания, Низкие температуры сами по себе без кристаллизации воды в окружающем растворе, т.е. без обезвоживания клеток внеклеточным льдом, безопасны. Те же работы показали, что свойства плазмалеммы в значительной степени зависят от ее белков состав и распределение котоРЫх изменяются после закаливания. В работе Иошиды [Yoarilola S., 1984 а] липосомы приготовленные из ДЖПИЇЇов плазмалеммы имели Фазовый ПОход при с /ществеНВО более самой плазмалеммы, и обработка этих везикул ггпоназой, удалявшая 50% бел Однако вывод Иошиды о роли белков в криоустойчивости плазмалеммы представляется сомнительным. Резкое увеличение после закаливания отношения фосфолипидов к Оелку могло быть вызвано не столько снижением белка в плазмалемме, сколько увеличением фосфолипидов. Спорным кажется и вывод об отсутствии изменений в ненасыщенности, поскольку есть и противоположные данные. В частности было показано, что культивирование клеток раувольфии при пониженной температуре (Т0(";) привели к поБышению в них в 2,5 раза количества главных фссфсдипидов дилинолеоилового типа и к ускорению слияния протопластов, изолированных из зтжк клеток, т.е. к увеличению ненасыщенно-стк и текучести плазмалеммы [ Yamaua Y., Нага Y. et al., 1980 1. Снижение времени вращения (периода поворота) спин-метки в жирных кислотах и, следовательно, увеличение подвижности липидов по мере закаливания наблюдали у морозостойких озимых ппюниц, причем в прямой зависимости от степени морозостойкости, в то время как у нем--розостойких подвижность уменьшалась, т.е. у них, очевидно, отсутствует механизм регуляции текучести в соответствии с температурой [ vigli L., Horvath I. et al., 1979 ]1 Флуоресцентные метки также показали увеличение текучести по снижению температуры фазового перехода мембранных липидов не только по мере закаливания пшениц [ Хохлова Л.П., Тимофеева О.А. и др., 1990 ]] но и суспензионной культуры клеток люцерны [ BorochoY А., Walker 1, et al=, 1989 ], а также у отселектированной семикратным замораживанием до жидкого азота и послед пощим оттаиванием стабильно последнем случае метку ВВОДИЛИ в изолированные везикулы плазма-леммы и обнаружили, что температура фазового перехода снижается не только у устойчивых клеток по сравнению с неустойчивыми, но и у тех, и у .других после обработки смесью криопротекторов при 0"С в течение 2 часов. Это время близко к обычному периоду уравновешивания клеток с криопротектором перед глубоки?/! замораживаннем. При этом у устойчивых клеток снижение температуры фазового перехода в
Упрощенные способы замораживания
На -этапе добавления криопротекторов очевидна необходимость оптимального подбора их концентраций и сочетаний. Помимо температуры, о чем сказано выше, большую роль играет также временной фактор во время этой операции. В большинстве работ криопротектор добавляли постепенно, но в ряде случаев, особенно при применении ДМСО, для некоторых клеток это не обязательно [ Попов A.С, Бутенко Р.Г. и др., 1978; Волкова Л.А., Попов A.C. и др., 1982, Попов A.С, Черняк Н.Д. и др., 1982 1. Важно было, с одной стороны, избежать чрезмерного для данных клеток осмотического стресса, вызванного самим криопротектором, и обеспечить достаточное время для уравновешивания клеток с раствором и проникновеыия в них эндоцеллюлярных его компонентов, а с даугой - исключить или снизить токсичность.
Если в состав среды для предкультивироаШния и в состав криозащит-ного раствора входили одни и те же вещества (в особенности хорощие криопротекторы), то в ряде работ их концентрацию в криозащитной смеси значительно повышали по сравнению с периодом подготовки, так как суммарное (до замораживания, в процессе его и после оттаивания до разбавленшя) время яействия яриопротектора аграничено обычно о - 2 часами и важно во время замораживания иметь действительно максимально переносимые концентрации [ Kartha К., Lenng N. et al.. 1982; Bhandal J., Hauptmann R. et al., 1985; Hunter С, 1986 ].
Как единственный криопротектор наиболее широко использовали ДМОО, который быстро проникает сам и способствуют проникновению другис веществ [ Nag К., Street H., 1973; Sala P., Oella R. et al.. 1979; Dougall D., Mi.ltten G., 1980; Kartlia K., Leung N. et al.. 1982; Zheng G.-в., He J.-Ъ. et al-, 1983; Chen T., Kartha K. et al., 1984 a; Jekkel Zs., Heszfcy L. et al., 1989; Norgaarcl J., Bal-dursaon S. et al., 1993 3. Обычные его концентрации 5 - 10%, но некоторые клетки и ткани выдерживали более высокие - до 24%. Например, 5%-ную концентрацию использовали с змбриогенными клеточными суспензиями и каллусами из нуцелярной ткани семяпочек ряда видов и сортов рода Citrus, но для каллусов лучшие результаты по восстановлению роста после оттаивания из жидкого азота были получены с 10 и 15% [ Engelmann В., Agullar M. et al., 1994; Engeemann F., Dambier D. et al., 1994 1.
Широко использовали также сахарозу [ Ba,ja,j Y., 1976; Попов A. С, Черняк Н.Д. и др., 1982; Haruyuki К., Yasunao N., 1983; Seits П., Reinharel E., 1987: GoMner E., Seits U.et al., 1991; Engelmann F., 1992 ] и иногда - сорбит [ Reutf I., Seits U. et al, 1988; Gnanapragasam S., Vasil I., 1990 3. йз других сахароз и близких веществ применяли трегалозу [ Goldner Е., Seits U.et al., 1991 3, доводя ее концентрацию при замораживании даже до 40% [ Bhandal J., Hauptmaim R. et al., 1985 1, мальтозу [ Dussert S., Mauro М et al., 1991, 1992 3, мелибиозу [ Goldner Е., Sells U.et al., 1991 3.
Пролин, как единственный криопротектор оказался не очень подходящим, несмотря на прекрасное действие его на клетках кукурузы и некоторых других растений из других семейств (не злаковых) [ Whers L., King Р., 1979, 1980; Goldner Е., Seits U. et al., 1991; Lee Y.H., Kim H.I. et al., 1993 3; известные защитные свойства его в условиях солевого стресса и низкую токсичность, благодаря которой его концентрация у некоторых солеустойчивых форм и клеточных штаммов может увеличиваться в сотни раз [ Ошмарина В.И., Шамина З.Б. и др., 1983; Шевякова Н.И., 1983 3. На клетках кукурузы получили криозащиту также и при применении других аминокислот: глицин-бетаина, гидроксипрюлина, аспартата и гамма-аминомаслянай кислоты [ Withers L., King Р., 1979 3. Использовали также гидролизат лактальбумина [ Zheng G.-z., Не J.-b. et al., 1983 3.
Глицерин, столь широко используемый для кржозащиты при глубоком замораживании клеток животных in vitro (у некоторых беспозвоночных он накапливается в гемолимфе к зиме до 10%-й концентрации), на клетках растений, как единственный криопротектор, использовали только в двух работах [ Sakal А., Kobayashi S. et al., 1991; Pais В., Dhed a D. et al., 1992 3. Обычно его применяли в смесях с сахарозой [ Nishlzawa S., Sakal А. et al., 1992 3 или с ДМСО [ Nag К., Street Н., 1975; Bafia,] Y., 1976; Hauptmaim R., Widholm J., 1982; laddox А., Gonsalves P. et al., 1983 3.
Сдаако, во многик случаях лучшей была трехкомпонентная криоза-щжтная смесь: 0,5 М ДМОО, 0,5 М глицерина и I М сахарозы или пролита [ Withers L., King Р., 1979, 1980; Pritchard H., Grout В. et al., 1982, 1986 a,b 3. Концентрации, впрочем, приходилось подби о;? рать для конкретных клеток [ Dlettrcli В,, Popov А.S. et al., 1982: Seltz и., Alfermann A. et al., 1983; Dlettrcii В., Haack U.et al,. 1985: Halme G., Lors H et al., 1987; Sim L. h., Jlan L.-c. et al.. 1990; Kessky L., Jekkel Zs. et al., 1990; Frets A., Jaime A. et al., 1992 ]. Некоторые авторы использовали все 4 компонента одновременно [ Meljer Е., таи Iren 3? et al., 1991; Jaln S., Jain R. et al., 1996 ].
Каллуоные клеточные культуры диоскорей кавказской и балканской
Чтобы убедиться в допустимости предлагаемого способа определения выживаемости по окраске путем подсчета КЕ провели сравнительное исследование четырех методов определения жизнеспособности: по электропроводности, нингидринового (эти методы основаны на экзоос-мосе электролитов или аминокислот, соответственно), цитологического при окрашивании феносафранином и счете КЕ (а не клеток) и метода, использующего хлористый 2,3,5-трифенилтетразолий (ТТХ) [ Оамы-гин г.А., Волкова Л.А. и др., 1985 ]. Последний основан на том, что окислительно-восстановительные ферменты (главным образом дегидро-геназы [ Пирс Э., 1962 3) живых клеток необратимо восстанавливаюд ТТХ (пропорционально своей активности) в ярко красный формазан, нерастворимый в воде, но извлекаемый из осадка клеток этанолом. Оптическая плотность раствора формазана в спирте измеряется затем на спектрофотометре. Аналогично поступают и при реакидис нингидри-ном. Выживаемость рассчитывали в процентах к контролю (клеткам, не подвергавшхмся никаким воздействиям), так как исходная жизнеспособность клеток в рззных зкспериментах была различной.
Были поставлены опыты, в которых смешивали в разных соотношениях живые и предварительно убитые клетки суспензионных и каллусных культур диоскореи дельтовидной и женьшеня. Затем в этих смесях определяли процент живых клеток. Полученные значения жизнеспособности, определенные четырьмя методами в 4-кратной повторности, укладывались на одну и ту же теоретическую прямую (Рис.1), причем ошибки всех этих методов оказались близкими. Следовательно, наш способ подсчета выживаемости по КЕ при окраске феносафранином или синим Эванса вполне сопоставим с давно апробированными и широко используемыми методами, которые, к сожалению, не обеспечивают существенно меньшего разброса значений. В то же время они сложнее и требуют намного больше времени, хотя и избавляют от утомительной (при большом числе вариантов) работе за микроскопом [ Самыгин Г.А., Волкова Л.А. и др., 1985 ].
Разумеется, наиболее правильным критерием в подобных исследозаниях остается подсчет колоний, поскольку он один позволяет судить о репродуктивной выживаемости, т.е. о сохранении клетками способности к неограниченному делению и, следовательно, к возобновлению культуры после оттаивания. Но эффективность высева суспензий клеток (вернее КЕ) растений при посеве на колонии без использования специальных приемов (ткань-нянька, слой клеток-кормилок, кондиционированные среды) очень низкая (см., например, ниже раздел о влиянии скорости замораживания) и, главное, образование колоний требует от 1,5 до 4-6 недель и стерильной работы после оттаивания, в то время как для подсчета КЕ при окраске под микроскопом достаточно нескольких минут на каждый вариант [ Попов A.С, Бутенко Р. Г. и др., 1978 ].
Однако окрашивание феносафранином, синим Эванса или другими подобными красителями, основашное на изменении проницаемости плаз-малеммы клеток, непригодно для определения жизнеспособности плотных каллусов, которые трудно мацерировать, не повредив при этом клетки, а также суспензионных культур с очень крупными агрегатами. В последнем случае под микроскопом обычно видны окрашенные клетки, расположенные в большем или меньшем количестве по поверхности агрегата, в то время как в глубине его нет ни одной окрашенной клетки. И всегда возникает дилемма: то ли клетки в середине действительно живые, то ли краситель просто не проник вглубь, В этих случаях может оказаться полезным применение флуоресцеин-диаце-тата [ Wldholm, 1972 1. Но нужен люминесцентный микроскоп или хотя бы осветитель.
Молодой (4-12 месяцев после введения в культуру) штамм этих клеток М-34 был очень гетерогенным. Его суспензия состояла из трех групп образований: свободных (изолированных) клеток, глазным образом крупных (49%), рыхлых агрегатов из небольшого числа хорошо отграниченных, рыхло связанных друг с другом клеток (30%) и плотных агрегатов из очень мелких, мало вакуолизированных, интенсивно делящихся клеток (22%) [ Попов А,С, Бутенко Р.Г. и др., 1978 ]= Е подобной культуре на 5-й день после пересева, когда мы брали суспензию в опыты, отмечали пик митотической активности, и она находалась в самом начале экспоненциальной фазы цикла С Мохамед A.A., Дмитриева H.H., 1977 J, В это время суммарная плотность всех пере-численных образований была 4-5 х 10 /мл. Наибольший интерес для нас представляли плотные агрегаты, так; как в них сооведоточена основная масса интенсивно делящихся клеток, которые лучше переносят ггооцесг; зампваживания-оттаивания. Эти агрегаты являлись центрами размножения культуры и формировали птюэмбриоидше клеточные массы. Вследствие быстрых делений, напоминающих ттробление зигот животных,
Исходная суспензия перед замораживанием имела 77-88% живых КЕ, в том числе среди плотных агрегатов - 94-97%, среди рыхлых - 69-76% и среди свободных клеток - 73-87%. Результаты процедуры глубокого замораживания-хранения-оттаивания показали, что рыхлые агрегаты, как правило, не выживают, так как лишь в некоторых из них часть клеток оставалась неокрашенной. Большинство живых клеток было сосредоточено в плотных агрегатах; часть свободных клеток (кроме наиболее крупных) также выживала (таблЛ).
